miR-652-3p通过靶向Nptn抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移

胥敏 陈正楼 王云江 火旭其 张新化 王宏盛

【摘要】目的探討miR-652-3p对胶质母细胞瘤（GAM）增殖和迁移的影响。方法用miR-652-3p模拟物转染胶质母细胞系C6和U87，然后分别通过CCK8、细胞流式、EdU、Transwell和划痕实验研究miR-652-3p对细胞增殖和迁移的影响。利用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和双荧光素酶报告基因实验检测miR-652-3p与Neuroplastin（Nptn） 的互作关系。通过CCK8、细胞流式、EdU、Transwell和划痕实验研究Nptn对细胞增殖和迁移的影响。结果miR-652-3p的过表达可以抑制C6和U87细胞的增殖和迁移；双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-652-3p可以与Nptn结合，Nptn表达水平受到miR-652-3p水平的影响；干扰Nptn的表达可以抑制C6和U87细胞的增殖和迁移。结论miR-652-3p通过靶向Nptn抑制GBM的增殖和迁移。

【关键词】miR-652-3p；Nptn；胶质母细胞瘤；增殖；迁移

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0043-07

miR-652-3p suppresses glioblastoma proliferation and migration by targeting Nptn XU Min， CHEN Zhenglou， WANG Yunjiang， et al. Department of Neurosurgery， Yancheng Third Peoples Hospital， The Sixth Affiliated Hospital of Nantong University， Yancheng School of Clinical Medicine of Nanjing Medical University， Yancheng 224002， China

Corresponding author： WANG Hongsheng

Abstract： ObjectiveTo investigate the effect of miR-652-3p on glioblastoma（GBM） cell lines. MethodsGBM C6 and U87 cell lines were transfected with miR-652-3p mimic， and then the effects of miR-652-3p on cell proliferation and migration were detected by CCK8， flow cytometry， EdU， Transwell and wound-healing assays， respectively. The interaction between miR-652-3p and neuroplastin（Nptn） was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）， Western blot and dual luciferase reporter gene assays. The effects of Nptn on cell proliferation and migration were investigated by CCK8， cytometry， EdU， Transwell and wound-healing assays. ResultsOverexpression of miR-652-3p inhibits the proliferation and migration of GBM cells. Nptn is a functional target of miR-652-3p. Interfering with the expression of Nptn inhibits the proliferation and migration of GBM cells. ConclusionmiR-652-3p suppresses GBM proliferation and migration by targeting Nptn.

Key words： miR-652-3p； Nptn； glioblastoma； proliferation； migration

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171038）；江苏医药职业学院临床学院专项科研发展基金课题项目（20219103，20229106）

作者单位：224002 盐城，盐城市第三人民医院神经外科，南通大学第六附属医院，南京医科大学盐城临床医学院

通信作者：王宏盛

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM） 是成年人中最常见的原发性脑部肿瘤，至今无治愈方法，其2年和5年生存率分别为16%和5%［1］。目前的治疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗和肿瘤电场治疗（tumor treating fields，TTFields）等［2］，但其治疗效果有限。随着分子生物学的进步，分子靶向治疗作为一种新的治疗策略，已经在包括GBM在内的许多癌症中得到了广泛的探索［3］。值得注意的是，关于非编码RNA参与调控GMB进展的研究正在兴起，为 GBM治疗提供新的思路。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一类高度保守的、内源性表达的小非编码 RNA［4］。它们通过与相应靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3′-非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR） 直接相互作用，通过抑制mRNA翻译或促进mRNA 降解来调节基因表达［5］。研究表明，miRNA的表达谱与癌症类型、分期、预后，以及其他临床变量相关联，miRNA失调已被证明在癌症的发生和发展中发挥重要作用［6］。

miR-652被认为子宫内膜癌［7］、非小细胞肺癌［8］、小儿急性淋巴细胞白血病［9］和胰腺癌［10］相关。然而，miR-652在GBM中作用及分子机制仍然很大程度上未知。因此，本研究旨在探讨miR-652-3p对GBM增殖和迁移的影响。

1资料与方法

1.1细胞系来源C6细胞系为N-亚硝基甲脲诱导的大鼠胶质瘤克隆，U87细胞是由Ponten J等建立，源于恶性神经胶质瘤，是上皮细胞样贴壁生长星形胶质母细胞瘤细胞，来自南通大学。

1.2主要材料与试剂DMEM/F12培养基和质量分数为0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone 公司。Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司。CCK8购自Beyotime公司。PI/RNase Staining Buffer购自美BD公司。EdU细胞增殖试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司。Fast Start Universal SYBR Green Master购自Roche公司。Dual-LuciferaseTM Reporter购自Promega公司。小鼠抗Neuroplastin（Nptn）单克隆抗体购自ThermoFisher Scientific公司（1∶500）。小鼠抗β-actin单克隆抗体购自Abcam 公司（1∶1 000）。辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠购自Pierce公司（1∶5 000）。增强化学发光试剂盒购自Amersham Bioscience公司。

1.3细胞培养取出冻存C6和U87细胞，经37 ℃水浴融化后，1 200 r/min，离心3 min后弃上清，用适当体积的完全培养基（DMEM/F-12含10% FBS）重悬细胞后放入培养瓶或培养皿，置于（37 ℃，5%CO2）培养箱中培养。miR-652-3p模拟物和阴性对照由广州锐博生物科技有限公司合成。Ntpn siRNA和阴性对照由Thermo Fisher Scientific公司设计合成。Lipofectamine 3000用于将基因转染到细胞中。

1.4CCK8实验将对照和处理组的C6和U87细胞以每孔1×104个细胞的密度接种于24孔板中，每组设置4个时间点，分别为转染后1 d， 2 d， 3 d， 4 d，每个时间点设置3个复孔。每孔加入50 μL CCK8溶液，充分混匀后于37 ℃培养箱中孵育2 h，用Synergy 2多功能微孔板检测仪检测450 nm处的吸光度，统计数据并分析。

1.5流式細胞术细胞分析细胞周期C6和U87细胞以每皿5×105个细胞的密度接种于100 mm的细胞培养皿中，细胞于培养箱中孵育过夜后，进行转染，并于转染后24 h后收取细胞。用1×PBS配制的75%的乙醇重悬细胞，置于-20 ℃， 24 h；1 200 r/min离心3 min；弃上清，1×PBS重悬细胞，1 200 r/min离心3 min；弃上清，每1×106个细胞取500 μL PI/RNase Staining Buffer重悬，室温避光静置30 min；使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.6EdU细胞增殖实验C6和U87细胞以每孔2×104个细胞的密度接种于有无菌细胞爬片的24孔板中。细胞于培养箱中孵育过夜后，进行转染，并于转染后24 h行后续EdU细胞增殖实验。细胞爬片经抗荧光淬灭封片液封片后可立即观察，或于4 ℃湿盒内保存待用，使用蔡司显微镜拍摄图像，Image J软件计数细胞。

1.7Transwell转染24 h后，将C6和U87细胞以1×104个无血清DMEM细胞密度接种在Transwell小室上层，而600 μL的完全培养基放置在下腔中。培养24 h后，用4%甲醛固定，0.1%结晶紫染色，用棉签去除小室上表面的剩余细胞，将细胞孔板置于显微镜下观察并拍照记录。

1.8划痕将C6细胞以密度5×105接种于细胞孔板上，并在孔板上划线标记，然后置于37 ℃，5%CO2培养箱中过夜培养，转染后用1 000 μL枪头垂直于细胞孔板的进行划线，而后继续培养，每组设置4个时间点，分别为划痕后0 h，24 h ， 48 h ， 72 h，将细胞孔板在不同时间段置于显微镜下观察并拍照记录。

1.9实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）细胞培养板中的细胞用Trizol裂解提取，总RNA按照RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒说明书将3 μg总RNA逆转录成cDNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master说明书，在StepOnePlus实时荧光定量PCR仪中进行RT-PCR，数据用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。实验所用引物（Sangon公司）如下。Nptn：正向5′-AAGGAGAATG-GTGTGTTTGAGGA-3′， 反向5′-GAGGACTGTGG-AAACGGAGG-3′;Gapdh：正向5′-CCACGGCAA-GTTCAACGGCACAG-3′， 反向5′-GACGCCAGTAGA-CTCCACGACAT-3′。

1.10Western Blot用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，测定浓度后进行凝胶电泳，Bio-Rad半干转印系统转膜，5％脱脂奶粉将膜室温封闭2 h，一抗孵育过夜（4 ℃）。二抗室温孵育2 h，通过增强化学发光试剂盒进行显像。

1.11双荧光素酶报告基因实验合成并克隆了预测的靶基因和突变体的3′-UTR 靶位点。C6和U87细胞种植于96孔板，并使用Lipofectamine 3000将质粒和miR-652-3p模拟物共转染。48 h后使用Dual-LuciferaseTM Reporter分析萤火虫和海肾萤光素酶活性。

1.12统计学分析数据以平均值±标准差（x〖DD（-*2〗-〖DD）〗±s）表示，实验至少重复三次，用GraphPad Prism 9统计软件分析数据，两组间比较采用双尾Students t检验，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1上调miR-652-3p抑制GBM細胞系增殖为了探索miR-652-3p在GBM发展中的生物学功能，合成了miR-652-3p模拟物和miR-NC，然后瞬时转染到C6和 U87细胞中。CCK8实验显示，与miR-NC组相比，miR-652-3p组在2 d、3 d、4 d组细胞增殖显著降低（图1A）。流式细胞检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-652-3p组S期细胞明显减少（图1B）。此外，miR-652-3p上调显著降低了 EdU阳性细胞比例（图 1C）。 因此，这些数据表明 miR-652-3p可以抑制 GBM细胞的增殖。

2.2上调miR-652-3p抑制GBM细胞系迁移为了检测miR-652-3p对GBM细胞迁移或侵袭能力的作用，在C6和 U87细胞中过表达miR-652-3p后通过Transwell和划痕实验检测细胞的迁移能力。Transwell实验结果显示在两种细胞中上调miR-652-3p后穿膜的细胞数量显著减少（图 2A）。划痕实验结果显示miR-652-3p过表达后细胞向划痕内迁移的速度明显减慢（图 2B）。 这些结果表明miR-652-3p可以抑制GBM细胞的迁移或侵袭能力。

2.3Nptn是miR-652-3p的靶基因为揭示miR-652-3p调控GBM生物学行为的机制，本研究通过TargetScan在线工具预测了miR-652-3p可能的靶基因。本研究发现miR-652-3p与Nptn的3′UTR结合区域存在相互结合位点（图3A），提示后者可能是miR-652-3p的靶基因。本研究利用qRT-PCR和Western Blot检测了miR-652-3p对Nptn表达的调控作用。结果显示miR-652-3p过表达后，Nptn的mRNA和蛋白水平均明显下调（图3B和C）。利用双荧光素酶报告基因实验检测二者的相互作用，结果表明，Nptn 3′UTR野生型组的荧光素酶强度明显下降，当3′UTR结合位点发生突变时，Nptn表达水平恢复到正常水平（图3D）。这些结果表明miR-652-3p能够与Nptn 3′UTR结合并抑制Nptn表达。

2.4下调Nptn表达抑制GBM细胞系增殖为了确定Nptn在GBM发展中的生物学功能，合成了Nptn小干扰片断，以si-NC为对照，分别瞬时转染到C6和U87细胞中。CCK8实验显示，与si-NC组相比，si-Nptn组在2 d，3 d和4 d组细胞增殖的数量显著减少（图4A）。流式细胞技术实验结果显示，与si-NC组相比，si-Nptn组S期细胞明显减少（图4B）。此外，EdU结合实验表明下调Nptn后，EdU阳性细胞比例显著降低（图4C）。 因此，这些数据表明Nptn可能在GBM细胞的增殖中起促进作用。

2.5下调Nptn表达抑制GBM细胞系迁移为了明确Nptn在GBM细胞迁移或侵袭中的作用，我们在GBM细胞系C6和U87中转染si-Nptn下调Nptn水平，利用Transwell和划痕实验检测细胞的迁移能力。Transwell实验结果显示，下调Nptn后穿膜的C6和 U87细胞数量明显减少（图5A）。划痕实验结果显示Nptn表达下调后细胞向划痕内生长的能力也显著减弱（图5B）。这些结果表明干扰Nptn可以抑制GBM细胞的迁移或侵袭能力，提示其对GBM的细胞迁移或侵袭正向相关。

3讨论

2002年已经证实miR-15和miR-16簇在慢性淋巴细胞白血病中低表达或缺失，首次表明miRNA在癌症进展中的作用［11］。在过去的一段时间里，miRNA与几乎所有已知的癌症过程有关。根据靶基因，一些miRNA经常对蛋白质编码癌基因产生负面影响，而另一些miRNA可以抑制已知的肿瘤抑制基因［12］。miRNA已成为基础和转化生物医学研究的一个有趣领域，因为它们对基因表达的调控以及在身体组织和体液中的强大存在，使得它们可作为疾病的生物标志物［13］。目前，对于癌症中miRNA的失调，还没有确定的理论或机制。考虑到生理系统的复杂性，可能有多种机制发挥作用，包括那些涉及miRNA生物发生成分、转录因子调控和miRNA链内突变的机制［14］。

先前的研究报道了miR-652在多种癌症中的异常表达。Sun等［7］发现miR-652通过直接靶向RORA，激活Wnt/β-catenin信号通路，影响子宫内膜癌的进展。Yang等［15］发现骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力以及p-PI3K、p-Akt、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的蛋白表达水平随着miR-652表达的增强而显著降低，而其靶基因HOXA9的过表达则逆转了这种情况。miR-652低表达的GBM患者的总生存期短于miR-652高表达的患者。本研究分析了miR-652-3p对GBM生物学行为的影响。体外功能测定表明，上调细胞内的miR-652-3p水平可以明显抑制GBM细胞增殖和迁移能力，表明miR-652-3p是GBM患者的潜在治疗标志物。但是miR-652-3p影响GBM生物学行为的下游信号分子尚不清楚。

本研究利用TargetScan分析发现，miR-652-3p与Nptn的3′UTR区存在相互结合序列。进一步检测发现miR-652-3p可以下调Nptn的表达。双荧光素酶报告基因实验表达miR-652-3p确实可以与Nptn的3′UTR区结合。说明Nptn是miR-652-3p的下游靶基因，这一结果属首次报道。但是，Nptn在GBM的生物学行为中是否发挥作用尚不知晓。Nptn属于细胞粘附分子家族的突触糖蛋白神经原激酶中的一类［16］。研究表明，Nptn是长期增强和联想记忆形成所必需的，对认知能力至关重要［17］。亦有研究发现Nptn在有远处转移的乳腺癌中高表达，且与肿瘤生长和血管生成显著有关［18］。另外，Nptn在循环肿瘤细胞中也高度表达［19］。在Kovacheva等［20］的研究中发现ITGB3 敲低后，Nptn表达在MDA-MB-231乳腺癌细胞中持续下调。以上研究表明，Nptn在肿瘤的发生发展中起着重要作用，但是关于Nptn在GBM中的作用尚不清楚。

本研究利用RNA干擾技术下调GBM细胞中的Nptn水平，结果发现Nptn水平下调后GBM细胞增殖和迁移均受到显著抑制，这一发现提示Nptn可能作为促癌基因存在，但还需要更多的实验进一步证实。

综上，本研究的结果表达miR-652-3p可能通过靶向Nptn抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移。但是，本研究仍然存在一些局限性。第一，miR-652-3p上游表达的机制需要进一步探索。第二，miR-652-3p有众多的预测目标，是否有其他靶基因也参与miR-652-3p的作用很大程度上仍然未知。最后，Nptn在GBM进展中具体调控机制需要进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

［1］Lucero R，Zappulli V，Sammarco A，et al.Glioma-derived miRNA-containing extracellular vesicles induce angiogenesis by reprogramming brain endothelial cells［J］.Cell Rep，2020，30（7）：2065-2074.e4.

［2］Yeh M，Wang YY，Yoo JY，et al.MicroRNA-138 suppresses glioblastoma proliferation through downregulation of CD44［J］.Sci Rep，2021，11（1）：9219.

［3］Zhang GL，Chen LK，Khan AA，et al.miRNA-124-3p/neuropilin-1（NRP-1） axis plays an important role in mediating glioblastoma growth and angiogenesis［J］.Int J Cancer，2018，143（3）：635-644.

［4］ Kilikevicius A，Meister G，Corey DR.Reexamining assumptions about miRNA-guided gene silencing［J］.Nucleic Acids Res，2022，50（2）：617-634.

［5］Xiao HP.MiR-7-5p suppresses tumor metastasis of non-small cell lung cancer by targeting NOVA2［J］.Cell Mol Biol Lett，2019，24：60.

［6］Lee YS，Dutta A.MicroRNAs in cancer［J］.Annu Rev Pathol，2009，4：199-227.

［7］Sun XM，Dongol S，Qiu CP，et al.MiR-652 promotes tumor proliferation and metastasis by targeting RORA in endometrial cancer［J］.Mol Cancer Res，2018，16（12）：1927-1939.

［8］Yang WH，Zhou CC，Luo M，et al.MiR-652-3p is upregulated in non-small cell lung cancer and promotes proliferation and metastasis by directly targeting Lgl1［J］.Oncotarget，2016，7（13）：16703-16715.

［9］Jiang Q，Lu XJ，Huang PL，et al.Expression of miR-652-3p and effect on apoptosis and drug sensitivity in pediatric acute lymphoblastic leukemia［J］.Biomed Res Int，2018，2018：5724686.

［10］Deng SC，Li X，Niu Y，et al.MiR-652 inhibits acidic microenvironment-induced epithelial-mesenchymal transition of pancreatic cancer cells by targeting ZEB1［J］.Oncotarget，2015，6（37）：39661-39675.

［11］Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］.Proc Natl Acad Sci？USA，2002，99（24）：15524-15529.

［12］He BX，Zhao ZY，Cai QD，et al.miRNA-based biomarkers，therapies，and resistance in Cancer［J］.Int J Biol Sci，2020，16（14）：2628-2647.

［13］Ferragut Cardoso AP，Udoh KT，States JC.Arsenic-induced changes in miRNA expression in cancer and other diseases［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2020，409：115306.

［14］Hill M，Tran N.miRNA interplay：mechanisms and consequences in cancer［J］.Dis Model Mech，2021，14（4）：dmm047662.

［15］Yang C，Chen Y，Xiong WH，et al.MiR-652 inhibits the proliferation，migration，and invasion of osteosarcoma cells by targeting HOXA9 and regulating the PI3K/akt signaling pathway［J］.J Oncol，2022，2022：4809312.

［16］Lin X，Liang Y，Herrera-Molina R，et al.Neuroplastin in neuropsychiatric diseases［J］.Genes，2021，12（10）：1507.

［17］Ilic K，Mlinac-Jerkovic K，Sedmak G，et al.Neuroplastin in human cognition：review of literature and future perspectives［J］.Transl Psychiatry，2021，11（1）：394.

［18］Rodriguez-Pinto D，Sparkowski J，Keough MP，et al.Identification of novel tumor antigens with patient-derived immune-selected antibodies［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58（2）：221-234.

［19］Powell AA，Talasaz AH，Zhang HY，et al.Single cell profiling of circulating tumor cells：transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines［J］.PLoS One，2012，7（5）：e33788.

［20］Kovacheva M，Zepp M，Berger S，et al.Conditional knockdown of integrin beta-3 reveals its involvement in osteolytic and soft tissue lesions of breast cancer skeletal metastasis［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2021，147（2）：361-371.

（收稿2023-01-03修回2023-04-05）