液体活检在胶质瘤中的应用及展望

依日扎提·艾力 王增亮 努尔斯曼古丽·买买提明 秦虎 汪永新

【摘要】胶质瘤是一种最常见的原发性颅内肿瘤，由于其早期诊断困难、解剖位置复杂及复发率高，导致其预后极差，使之成为致死性最高的恶性肿瘤之一。近几年来，随着二代测序技术的发展，液体活检以可重复性和微创为特点在胶质瘤的早期发现、耐药监测、靶点检测及预后预测中表现出了良好的应用前景。然而，液体活检在胶质瘤患者临床应用中仍面临着一系列的挑战，本文综述液体活检及其生物标志物在胶质瘤中的研究进展及其临床应用。

【关键词】胶质瘤；液体活检；脑脊液；生物标志物

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0091-04

Application and prospect of liquid biopsy in glioma Yirizhati Aili， WANG Zengliang， Nuersimanguli Maimaitiming， et al. Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Corresponding author： WANG Yongxin

Abstract： Glioma is one of the most common primary intracranial tumors. Due to difficulty of early diagnosis， complicated anatomical location and high recurrence rate， it has a very poor prognosis， making it one of the most fatal malignant tumors. In recent years， with the development of second-generation sequencing technology， liquid biopsy characterized by reproducible and minimally invasive methods has shown promising applications in the early detection， drug resistance monitoring， target detection and prognostic prediction of glioma. However， liquid biopsy still faces several columns of challenges in the clinical application of glioma patients. Therefore， this paper will explore the progress of liquid biopsy and its biomarkers and its clinical application in glioma.

Key words： glioma; liquid biopsy; cerebrospinal fluid; biomarkers

基金項目：新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目（2022D01D70）；新疆维吾尔自治区区域协同创新专项（上海合作组织科技伙伴计划及国际科技合作）项目（2021E01013）

作者单位：830054 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院神经外科中心（依日扎提·艾力，王增亮，秦虎，汪永新），干部保健中心（努尔斯曼古丽·买买提明）

通信作者：汪永新

胶质瘤是中枢神经系统最常见的成人恶性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的75%～80%。根据WHO分级分为Ⅰ-Ⅳ级，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的恶性程度最高，平均总生存期不足14.6个月［1］。胶质瘤传统的诊断和治疗手段主要以组织活检为标准，但由于肿瘤异质性、特殊的解剖部位及侵袭性等原因使得其在临床上仍具有一定的局限性［2］。液体活检则在一定程度上弥补了传统活检的局限性，从诊断到指导个体化治疗具有重要的意义和应用前景。

1液体活检

“液体活检”通过监测尿液、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）及血液等样本中肿瘤起源的原发性或转移性肿瘤病变脱落的细胞，循环DNA、RNA及循环外泌体等，实现肿瘤的早期、动态及低创监测。由于传统活检无法动态检测肿瘤发展过程，同时难以捕捉较小的病灶，因此，由于非侵入性诊断工具的不断发展，液体活检因其优势在多种实体肿瘤的诊断和治疗中广泛应用［3］。对于中枢神经系统肿瘤患者而言，液体活检最常用的标本主要是CSF、血液及唾液。其中，CSF可以与中枢神经系统内病灶直接接触并包含肿瘤代谢产物，因此CSF成为中枢神经肿瘤液体活检理想的样本［4］。1990年科学家首次在疱疹性脑炎患者CSF中，检测出病毒特异性DNA。此后，Siegal等［5］在胶质瘤CSF来源的循环DNA中检测到p53基因突变。随后液体活检逐渐成了胶质瘤基础和临床研究的新热点，有望替代传统活检，进而帮助胶质瘤患者制定更好的治疗方案。

相对于传统的组织病理活检而言，液体活检不会对脑组织造成损伤，可以在疾病不同阶段连续进行，在肿瘤进展的不同时期可检测到原发肿瘤相关遗传信息，从而实现早期诊断、动态监测及评估预后，因此成为一种有前途的监测工具。

1.1胶质瘤中的CTCs检测循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是从原发灶的胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞脱落并进入血管、CSF或唾液的游离肿瘤细胞，因此CTCs具有肿瘤细胞和干细胞的特性，包含原发肿瘤的特异性遗传物质和肿瘤分子表型等重要的信息［6］。目前多项研究证实，CTCs在肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤和嗜铬细胞瘤等多种实体肿瘤的早期诊断、评估疗效和预后中具有一定的作用［7］。但是，由于目前CTCs最常用的方法依赖于监测上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），而该分子在胶质瘤细胞中不表达，导致CTCs在胶质瘤患者中检出率约为21%～82%［8］，从而限制了其在临床上的实际应用。

研究表明，胶质瘤患者CSF中的CTCs具有高间充质和少量的神经信号，随着表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）拷贝数增加，染色体数量也改变（3、7和12号染色体增加，10、13和22号染色体丢失），此过程与原发肿瘤同步。使用二代测序（next generation sequencing，NGS）或更敏感的靶向检测方法对胶质瘤患者CSF中的CTCs进行突变分析可能有助于筛查复发风险较高的GBM患者和直接动态干预治疗策略。因此，GBM患者CSF中的CTCs分析有助于更确切地区分分子亚型，因此可以作为评价预后和疗效的生物标志物［9］。此外，CTCs状态与胶质瘤患者的临床特征有密切联系，CTCs阳性与治疗耐药、局部复发和较短的无进展生存期显著相关；同时，对于晚期GBM患者CTCs的动态监测具有区分肿瘤复发和假性进展的能力［10-11］。因此，表明CTCS计数反映了疾病状态，随着病情进展而增加，而在放化疗之后会下降。CTCs分析可能作为常规MRI的补充，更确切地监测GBM患者病程变化。

虽然CTCs在GBM患者中有很大的应用前景，但是其在临床环境中仍受到质疑和挑战。首先，GBM患者CSF中提取CTCs存在浓度低及方法复杂等缺点。其次，由于肿瘤细胞基底膜的异质性，从单个分析CTCs的分子亚型和特征所获得的信息不能充分代表患者整个病变进展。最后，到目前为止关于GBM患者CSF中CTCs的研究数量有限，各研究所包含的患者样本量较少，没有长期研究数据，所得出的研究结果存在质疑。

1.2胶质瘤中的循环肿瘤核酸检测循环肿瘤核酸（circulating tumor nucleic acids，ctNAs）包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA、ctDNAs）和循環肿瘤RNA（circulating tumor RNA、ctRNAs），它们通过病变组织的分解释放到血液、CSF以及尿液中［12］。分析ctNAs的难点是需要高灵敏度和特异度的技术来提取循环中低浓度的ctNAs，同时需要与正常细胞释放的高浓度循环游离DNA和RNA分离。在晚期的实体肿瘤，如晚期肺癌患者血液中存在较高浓度的ctNAs，并且已被广泛研究证明是预测全身治疗反应的早期预测因子［13］。

相关研究已表明，ctNAs已在一些原发性中枢神经系统肿瘤患者中检测到，包括星型胶质细胞瘤和少突胶质细胞瘤。在一项研究中，所有少突胶质细胞瘤和80.5%星型胶质细胞瘤患者血清中可以检测到较高浓度的ctDNAs，并且ctDNAs中显示肿瘤相关特异性生物标志物［O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因子甲基化/10q LOH/1p或19q LOH］［14］。另一项研究中，在33例中枢神经系统肿瘤患者（7例原发性GBM，8例星型胶质细胞瘤，2例胶质肉瘤，6例脑膜瘤和10例转移瘤）的血清中检测与原发性中枢神经系统肿瘤相关的基因（MGMT、RASSF2B、CDKN2A）甲基化状态。结果显示，星型胶质细胞瘤组70%的患者血清ctDNAs中，检测到至少一个基因启动子甲基化；同样，转移瘤组中的7例患者和脑膜瘤组中的3例患者中，检测到至少一个基因启动子甲基化；在5例GBM患者血清中检测到较低浓度ctDNAs并发现与原发肿瘤相关的生物标志物。但是与其他肿瘤区别的是，GBM患者血清中ctDNA的浓度和阳性率均较低［15］。2014年，Bettegowda等［16］证实CSF是比血清更好的，作为检测原发性脑部肿瘤来源的ctNAs的样本。Huang等［8］对35例中枢神经系统患者进行CSF的ctDNAs进行测序，结果显示74%的样本中含有原发肿瘤DNA，且肿瘤DNA的检出率与肿瘤的解剖位置和肿瘤分级有关，而与肿瘤大小无关。Baraniskin等［17］发现，胶质瘤患者CSF的ctRNAs中miR-15b和miR-21的联合检测可以区分胶质瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤。由于在治疗过程较容易获得患者CSF，动态监测患者CSF或血液中的ctNAs不但有助于疾病的早期诊断，也有望实现不同阶段的个体化治疗。

1.3胶质瘤中的循环外泌体检测外泌体（exosomes）是被膜包裹的胞外囊泡，一般直径为40～100 nm，多种细胞在正常及病理状态下均主动分泌外泌体，它携带了各种细胞成分，如蛋白质、核酸（mRNA、DNA、非编码RNA）和脂类。外泌体可以介导细胞间通讯，通过释放包含的生物因子，从而改变受体细胞的分子活动。因此，肿瘤细胞释放的外泌体中含有肿瘤特异性生物标志物并可以检测到原发肿瘤特点。一项研究结果表明，移植人类癌症干细胞的小鼠模型中，小鼠CSF中检测到肿瘤细胞相关的胞外囊泡［18］。另一项研究表明，在胶质瘤患者中低级别和高级别胶质瘤患者CSF中都可以分离胞外囊泡，并且反映病变进展程度［19］。这些研究结果证明，外泌体可用于检测临床相关的预后生物标志物，如CSF来源的胞外囊泡中检测到 IDH1-R132H的突变。

一项研究中，随访检测肿瘤切除术后胶质瘤患者血浆外泌体中基因表达情况，结果表明这些胞外囊泡与肿瘤切除后复发有关，其外泌体中特异性miRNA的差异表达可为胶质瘤的诊断和监测药物耐性提供新的生物标志物［20］，进一步地证明CSF或血浆中外泌体分析有助于胶质瘤的早期诊断、评估预后以及检测对化疗药物的耐药性。

2样本的选择

CSF被认为是一种包含大量肿瘤信息的、可分析循环肿瘤标志物的理想液体活检样本。虽然获取CSF途径是有创操作并具有一定的风险，并不是所有患者都能承受风险，但是与传统取活检相比，它是一种微创手术活检，获取较简单、创伤小。在胶质瘤患者中CSF可作为液体活检的样本，可以动态监测疾病进展，但这个过程需要患者同意并反复进行腰椎穿刺［21］。

目前研究表明，在胶质瘤患者CSF中可以提取较高浓度的ctDNAs，而ctDNAs的浓度相比血清中的浓度高，这一结果表明CSF是比较理想的液体活检样本［22］。在一项研究中，采用NGS对85例胶质瘤患者CSF的ctDNA进行分析，其中WHO分级Ⅳ级46例，Ⅲ级26例，Ⅱ级13例，其中49.4%的患者CSF的ctDNAs中检测到基因改变，20例患者的实体组织活检样本与CSF的ctDNAs分析的基因都有相似的突变。同时，CSF中的ctDNAs也显示拷贝数改变、启动子突变、蛋白质编码突变和结构重排，尽管患者缺乏肿瘤分级、病程或既往病史，但ctDNAs分析的上述变化与较差的预后相关，且具有指导用药的作用［9］。一项对继发性脑转移瘤的原发性肺癌患者的研究支持上述观念，认为CSF是理性的液体活检样本。该研究通过NGS方法分别对CSF的ctDNAs和血清的ctDNAs突变模式进行了检测，结果表明与原发肿瘤相关突变基因在CSF ctDNAs、血清ctDNAs和CTCs中阳性率分别为95.2%（20/21）、66.7（14/21）和39%（8/21）。12例患者（57.2%）通过CSF中生物标志物分析可以检测到EGFR突变，而通过血清ctDNAs和CTCs检测到5例。CSF中ctDNAs EGFR的突变与原发性肿瘤EGFR的突变一致率为88.9%［14］。

综上所述，对于中枢神经系统肿瘤CSF可以作为更可靠、更理想的液体活检样本，是因为CSF本身在脑室和脊髓腔内循环流动，能直接接触病变组织，含有大量的肿瘤脱落细胞及代谢产物。然而，由于CSF液体活检用于动态连续检测疾病进展，而CSF获取具有一定的侵袭性，不同个体接受程度不同，所以这需要在实际临床中权衡其利弊。CSF液体活检在临床中的应用价值还需进一步研究证实。

3液体活检在胶质瘤临床诊疗中的应用

随着基因芯片技术的大力发展，液体活检在胶质瘤诊断、预后及疗效评价中展现出了巨大的应用前景。Baraniskin等［17］首次报道在CSF中miR-15b和miR-21的联合检测可以用于胶质瘤的早期诊断。随后，Teplyuk等［23］也发现，CSF中miR-10b和miR-21可以将胶质瘤和其他神经系统疾病鉴别，而miR-200家族则有助于鉴别脑转移瘤和胶质瘤。同时，已有研究表明［18］，CTCs和外泌体可用于诊断可外科手术治疗的胶质瘤，其随着胶质瘤恶性程度的增加在血液和CSF中CTCs和外泌体数量增加。此外，一些研究表明CSF中特定的生物标志物也可以用于胶质瘤的早期诊断［24］。

此外大量的研究表明，特定CTCs或ctNAs的异常表达与较短的总生存期（overall survival，OS）和/或无进展生存期（progression free survival，PFS）显著相关，提示可能在中枢神经系统肿瘤患者中具有预测预后的价值。Martínez-Ricarte等［25］研究分析来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的2个肿瘤组（包括 648 例弥漫性胶质瘤）的 异柠檬酸脱氢酶1（isocitric dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2、TP53、TERT、ATRX、H3F3A 和 HIST1H3B 基因突變，对20例胶质瘤患者的临床肿瘤标本及CSF中上述7个基因进行的靶向外显子测序和微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）分析发现，CSF-ctDNA可对肿瘤进行准确地组织病理分型，并与预后相关。禹金良等［26］在胶质瘤患者CSF中发现，PIK3CA、KRAS、EGFR突变基因匹配到潜在耐药药物，对临床靶向治疗具有指导作用。Zhi等［27］的研究证实了9个miRNAs组合是一个独立于其他临床病理因素的重要预后评估指标，其还观察到星形细胞瘤患者血液中9种miRNAs，包括miR-15b、miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-106a、miR-182、miR-182、miR-520h的表达水平均比健康组显著增高，而手术后这9种miRNAs的表达水平明显降低。以上述种种证据初步表明，基于胶质瘤患者中CSF和血浆的液体活检，可用于肿瘤的诊断、预后及疗效评价的生物标志物分析，然而液体活检在临床诊疗中处于初步应用阶段，仍需要大量的研究证实。

4结论

大量的研究结果表明，对胶质瘤患者中CSF和血浆的液体活检，可以作为组织活检的潜在替代品，用于胶质瘤的诊断和预后生物标志物。考虑到传统取活检相对困难及风险较高，而开发与肿瘤发展相关生物标志物是胶质瘤个体化治疗趋势中必不可少的。液体活检提供了更安全、更方便的技术来获取肿瘤相关分子信息，可以低创动态地对疾病进行诊断、调整治疗方案以及有助于靶向药物的研发。然而，这些研究规模较小，尚不能形成有力的统计学结论来证明肿瘤生物标志物的检测与疾病参数的相关性。而且液体活检需要依靠一些较前沿的技术如NGS，数字PCR等，技术成本较高且对检测人员要求也高，因而限制了其在临床中的应用。因此，这些需要大量的研究验证液体活检技术在胶质瘤患者中的有效性和可靠性，同时需要不断地开发更简单、更准确的方法来进行生物标志物的监测及疗效评估等。

利益冲突： 所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

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（收稿2022-10-20修回2023-01-31）