基于细胞自噬调控的中药治疗溃疡性结肠炎药理机制研究进展

梁宇晗 王洪双 何慧彬 郑敏 赵琰 李彤 赵沛东 王石红

溃疡性结肠炎(ulcerative coltis,UC)是一种原因不明的慢性非特异性结肠炎症性疾病,临床上主要表现为持续或反复发作的腹泻、腹痛、里急后重和粘液脓血便,多累及全结肠甚至回肠,以直肠和乙状结肠最为常见[1]。其发病与上皮屏障功能障碍、免疫失衡、遗传易感性及外界环境等密切相关[2]。目前的研究认为自噬参与UC的发生发展,通过自噬改善UC疾病活动是一种可行的治疗方法[3]。

自噬是真核细胞在应激状况下所产生的一种非损伤性应答,通过溶酶体降解微生物、受损蛋白及损伤衰老的细胞器,实现重新利用和更新,从而维持细胞内环境的稳态平衡,是真核细胞独有的自我保护机制[4]。基于自噬的中医药疗法已被广泛应用于临床治疗,大量研究表明中药单体及复方中的有效成分能够通过调控自噬改善UC症状,具有潜在的临床应用价值。现就近年来中药单体(或其活性成分)及复方通过调控自噬改善UC的药理机制研究进行综述,旨在为深入研究中药治疗UC提供新的思路。

1 改善肠道黏膜屏障功能

肠粘膜屏障受损是导致UC发生发展的一个重要因素。肠道黏膜遭到破坏,通透性增加,肠道内各种毒素产物侵入肠道上皮,引起细菌移位、固有免疫损伤、线粒体功能障碍和铁死亡等病理过程[5]。研究显示,自噬在维持肠黏膜稳态方面发挥着重要作用[6]。

1.1 修复受损黏膜机械屏障

肠粘膜机械屏障是黏膜屏障的重要组成部分,主要由黏膜上皮细胞及其紧密连接(tight junction,TJ)成分组成,其中咬合蛋白(Occludin)是TJ蛋白主体组成成分,可与紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)结合以封闭细胞间隙,形成防渗透屏障,抵御病原微生物入侵[7]。研究显示,低、中、高剂量人参败毒散可上调腺苷酸活化蛋白α(activated protein kinase α,AMPKα)mRNA表达水平,增加磷酸化蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)、磷酸化Unc-51样激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)、Occludin蛋白表达及增高LC3Ⅱ/Ⅰ值,降低p62、封闭蛋白-2(Claudin-2)表达,其中以中剂量组干预效应最明显,表明人参败毒散可能通过激活AMPK/ULK1自噬通路,调节紧密连接蛋白Occludin、Claudin-2的水平,改善结肠黏膜通透性,并修复肠道黏膜机械屏障损伤[8]。

另有研究显示上游调控因子AMPK可降低自噬调控核心因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性以促进自噬发生,AMPK/mTOR通路介导的自噬能够明显缓解UC症状[9]。应艺[10]先后进行了动物实验和细胞实验,观察黄芪多糖对结组织中黏膜屏障相关指标的影响,包括Claudin-1、Occludin蛋白,自噬效应蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3B)、泛素结合蛋白(p62)和炎症相关指标肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、IL-8等,以及自噬相关基因Atg5肠、Atg7、Atg16L,研究结果认为黄芪多糖可以提高组织自噬能力,有效缓解肠道炎症及肠粘膜损伤。

1.2 减轻肠上皮细胞凋亡

细胞凋亡是细胞自身正常死亡过程,在机体防御体系中发挥重要作用,UC发病过程中存在结肠上皮细胞凋亡情况,而细胞自噬与细胞凋亡关系密切[5,11]。研究表明自噬的激活能直接控制UC中炎症因子TNF诱导的肠上皮细胞凋亡。

木樨草素是一种天然黄酮类化合物,高剂量的木樨草素可明显改善DSS介导发生的结肠上皮损伤、水肿和结构扭曲,通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路,增加细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2磷酸化,减弱caspase-9、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP等凋亡相关蛋白表达,抑制自噬水平,干预结肠组织细胞凋亡[12]。在李兰珍等[13]观察芍药苷治疗UC大鼠的实验中,发现芍药苷能够下调抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达和TNF-α、IL-6含量,上调自噬相关蛋白Beclin1表达,推测芍药苷可能通过抑制NF-κB信号通路,解除自噬抑制,促进了肠上皮细胞的功能修复。

经吴玉泓团队验证,理中汤合四神丸可激活脾肾阳虚型UC大鼠JNK/Beclin1/Bcl-2自噬信号通路,经中药干预后结肠组织中的丝氨酸苏氨酸激酶(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)、Bcl-2、Beclin1、LC3B、损伤调节自噬蛋白1(damage regulated autophagy modulator 1,DRAM1)相关蛋白和Atg5、Atg12自噬相关基因表达被抑制,同时P62表达上调,自噬水平被抑制,过度自噬被避免,缓解了结肠粘膜细胞凋亡,保护了结肠黏膜[14-15]。健脾清热活血方是劳绍贤教授总结多年临床治疗UC的经验拟成的方子,张涛等[16]运用健脾清热活血方治疗溃结癌变小鼠,结果中药组P85蛋白、周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cyclin-dependent protein kinase 1,CDK1)、P85 mRNA、p-Akt mRNA表达下降,推测健脾清热活血方可能通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制细胞凋亡与自噬,促进肠道炎症缓解与黏膜修复。

2 调节免疫炎症反应

在UC模型中,免疫细胞的浸润会影响肠道粘膜稳态和功能,进一步导致炎症反应。自噬参与机体免疫系统的调节,自噬缺陷会导致细胞毒性T细胞向T辅助淋巴细胞募集,增加炎症因子表达,诱发炎症反应[17]。因此,通过调节肠道炎症因子水平来抑制免疫细胞的浸润也可能是治疗UC的一种方法。

2.1 抑制NLRP3炎性小体活性

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor domain-containing protein 3,NLRP3)、衔接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,凋亡相关斑点样蛋白)和半胱氨酸蛋白酶前体(pro-Caspase-1)组成炎症小体,活化的NLPR3炎症小体可以对pro-Caspase-1蛋白进行剪切形成Caspase-1,Caspase-1处理pro-IL-1β和pro-IL-18,形成成熟的IL-1β和IL-18[18],然后触发免疫反应[19]。丁文文[20]实验中的治疗组在给予吴茱萸碱后,结肠组织炎性细胞浸润减少,髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、IL-1、IL-18水平降低,并破坏ASC自身寡聚化及ASC与Caspase-1的共定位而阻碍NLRP3炎性小体的组装抑制其激活,LC3-Ⅱ及p62蛋白的变化初步证明吴茱萸碱可通过增强自噬抑制NLRP3炎性小体的激活。刘琦[21]的研究证明NLRP3炎性小体参与UC发生发展过程。忍冬苷是金银花中最丰富的成分之一,胡乃华团队[22]认为忍冬苷可能通过激活EZH2-ATG5-NLRP3通路,增强自噬,加速NLRP3炎症小体的降解,并显著缓解UC。

2.2 减轻炎症损伤

刘晓兰等[23]运用苍术挥发油干预UC大鼠,治疗组IL-6、TNF-α明显被抑制,Beclin1蛋白、p62 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显上升,说明苍术挥发油保护大鼠结肠组织免受炎症损伤,可能与促进自噬有关。雷公藤多苷片具有很强的抗炎和免疫调节作用,王章流等[24]用其灌胃治疗UC小鼠,认为雷公藤多苷片通过下调LC3Ⅱ/Ⅰ比值抑制自噬活性,从而缓解DSS诱导的小鼠结肠急性炎症反应。

湿生扁蕾酮提取自龙胆草,具有抗肠纤维化、抑菌、消炎等药理作用。张旭东等[25]运用各剂量湿生扁蕾酮治疗肠纤维化UC大鼠模型,发现干预后结肠组织炎症明显减轻,Atg16L1、LC3蛋白表达下降,推测湿生扁蕾酮通过抑制自噬活性,发挥减少炎性因子和抵抗结肠纤维化的作用。复方蜥蜴散是朱西杰教授根据多年临床经验总结用来治疗UC的自拟方,能够调节肠道菌群紊乱,维持肠道稳态[26]。王艺臻等[27]还发现此方能够使自噬恢复正常,实验结果高剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调、p62水平上升,阐述了复方蜥蜴散通过维持正常自噬,清除受损细胞器、蛋白质,隔离有害蛋白,明显缓解UC大鼠粘液脓血便症状,修复肠道溃疡,降低炎症反应。

罗云坚教授团队认为病变黏膜组织内过多沉积的异常蛋白、炎性因子、受损细胞器等可通过干预Akt/mTOR信号通路,导致通路下游炎性因子失衡,而通过实验验证发现以清解伏毒法立方的调肠消炎片,可调控巨噬细胞的自噬状态,影响促炎因子IL-1β、抑炎因子IL-4的表达,有效缓解了UC大鼠结肠组织炎症反应,促进溃疡愈合[28]。牟永旭等[29]研究半夏泻心汤对UC的作用机制,经半夏泻心汤干预后,各剂量组血清中TNF-α、IL-6含量减低,结肠组织中PI3K和Akt蛋白也有不同程度的降低,结果证明半夏泻心汤缓解UC炎症反应可能与抑制促炎因子的表达和PI3K/Akt信号通路的活化促进自噬有关。

青藤碱提取自中药青风藤,具有良好的抗炎和免疫抑制活性作用。谢小荣等[30]运用盐酸青藤碱治疗UC小鼠,结果表明经治疗后TNF-α、IL-6含量降低,IL-10含量升高,改善炎症因子之间分泌失衡状态,同时p62蛋白表达显著降低,Beclin1、LC3B蛋白表达显著升高,提示盐酸青藤碱缓解结肠炎症损伤可能与解除自噬抑制有关。

2.3 调节肠道黏膜免疫应答

翻白草是彝医用来治疗肠炎、腹泻的常用药物。刘宇等[31]运用翻白草治疗UC大鼠,发现其可能是通过调节NF-κB的表达来防止过度的炎性小体激活,翻白草组结肠组织中p62、线粒体自噬标志蛋白parkin、NF-κB的mRNA转录水平上升,标志着线粒体自噬的激活,同时T细胞的生成增加,调控免疫反应,抑制了体内促炎因子的表达,增加了抗炎因子的含量,最终恢复肠道黏膜免疫功能,调整肠黏膜免疫失衡带来的大鼠肠黏膜损伤。王坚衡[32]实验验证白藜芦醇可以激动小鼠结肠组织中沉默调节蛋白1(recombinant sirtuin 1,SIRT1)、mTOR蛋白,下调Atg12、Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表达,激活SIRT1/mTOR信号通路,降低自噬水平,缓解结肠黏膜病理变化,减少TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的聚集,增加IL-10表达,调节CD4+T、CD8+T细胞的比例,避免Th1/Th2的免疫调节失衡,从而治疗UC。

司晓丽等[33]实验验证了芍药苷可通过上调自噬水平减轻葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)造成的大鼠肠道损伤,经干预后组织中炎症因子IL-17、TNF-α及细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecules,ICAM)分泌减少,自噬相关因子LC3BⅡ、Beclin1水平上调。IL-17是IL家族研究最广泛的促炎细胞因子,被认为是是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁,其与受体结合,可激活MAPKs、NF-κB等信号通路,诱导IL-6、IL-8、ICAM-1等促炎细胞因子和趋化因子释放,进而导致单核细胞、中性粒细胞募集及炎症的产生[34]。

3 调节肠道菌群

肠道菌群失衡是UC发病机制之一,在UC发病过程中起着重要作用。肠道菌群失衡是由于肠道菌群数量失调引起的,它可以通过多种机制引起UC的发生发展,益生菌群通常可以调节肠道菌群平衡,起到缓解结肠炎作用[35]。有些中药成分可能通过调节肠道菌群促进自噬进而改善UC症状。

SU等[36]研究黄柏碱对UC的治疗作用,进行网络药理学验证表明黄柏碱是复方黄柏液的主要成分,且靶点主要影响AMPK和mTOR信号通路,进一步构建UC动物模型,经干预后黄柏碱组p-AMPK/AMPK比值、自噬标记的LCII/LCI比值增加,p-mTOR/mTOR比值下降,表明黄柏碱干预可以促进自噬水平增加。肠道菌群测序分析还发现黄柏碱组小鼠的菌群更接近正常,增加了菌群丰度和有益菌含量,提示黄柏碱能够减少肠道损伤调节肠道菌群可能与调节AMPK-mTOR信号通路增强自噬有关。

盐酸小檗碱(黄连素)是许多常用中药(黄连、黄柏)的主要成分。CAO等[37]运用盐酸小檗碱治疗炎症性肠病动物模型,实验结果显示盐酸小檗碱高剂量组丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量降低,总抗氧能力、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutas,SOD)含量增加,结肠紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、E-钙粘蛋白、ZEB1、Occludin mRNA表达水平上调,slug蛋白表达增加,N-钙粘蛋白表达下降。同时,盐酸小檗碱高剂量组Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)、NF-κB mRNA表达显著降低,IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达也降低,表明TLR4/NF-κB通路受到抑制,Atg5、Atg7、LC3蛋白的表达增加,p62表达下降和p-mTOR表达增加,表明mTOR复合物和自噬激活,厚壁菌门/拟杆菌门比率和乳酸杆菌丰度也增加,总体微生物群达到健康水平,说明盐酸小檗碱能够缓解结肠损伤和炎症、维持肠道抗氧化系统和微生物稳态,可能与抑制TLR4/NF-κB炎症通路并激活mTOR复合物和自噬有关。

4 减轻氧化应激损伤

4.1 增强抗氧能力

在UC炎症区域,由于血管受损和代谢增加导致耗氧量增加,黏膜微环境处于缺氧状态,造成黏膜保护因子受损,肠粘膜屏障遭到破坏;氧化应激是氧化与抗氧化作用失衡的反应,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累过多,而可清除氧自由基的SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等酶活性减低,造成周围组织损伤,结肠组织屏障受损[38-39]。

金丝桃苷属黄酮醇苷化合物,主要存在于金丝桃属和山楂属植物中。于晓萍等[40]的实验中,金丝桃苷对大鼠结肠炎症有明显的治疗作用,通过下调结肠组织中IL-1β、TNF-α、MDA、MPO水平,提升SOD活性,LC3、Beclin1水平上升,p62水平下降,证明金丝桃苷可增强自噬水平,发挥抗炎抗氧化作用。氧化苦参碱是从豆科植物苦参中提取出的主要活性成分,具有较强的抗炎、抗癌、抗氧化、抗纤维化等作用[41]。经氧化苦参碱干预的UC小鼠结肠黏膜细胞的ROS、MDA和MPO含量显著减少,SOD、GSH-Px含量均增加,Atg5和Beclin1蛋白表达显著增加,证明氧化苦参碱减轻由ROS引起的一系列级联反应可能与提高自噬水平有关[38]。

薯蓣皂苷是一种植物甾体皂苷,具有抗炎、抑菌、降血脂等作用。李瀚等[9]研究薯蓣皂苷的机制发现其能够减轻DSS对SOD、GSH的抑制,增加p-AMPK蛋白水平,降低p-mTOR表达。同时,经其干预后Beclin1、Atg5蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增高,p62蛋白显著下降,自噬被激活,因此研究分析薯蓣皂苷可能通过调节AMPK/mTOR信号通路促进自噬,抑制氧化应激。

白术内酯具有抗炎、抗肿瘤等作用。任燕等[42]通过实验白术内酯Ⅲ干预UC小鼠模型,探究其治疗机制,结果SOD、GSH-Px含量明显升高,MDA含量明显降低,且Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高,p62表达明显降低,镜下观察也发现白术内酯Ⅲ组线粒体膨胀变形、受损线粒体被自噬小体所吞噬,并且溶酶体与受损线粒体进行了融合,表明白术内酯Ⅲ可能通过调节自噬,清除过氧化物,缓解UC炎症。

中药方剂香连丸出自《太平惠民和剂局方》,临床主要用于治疗湿热痢疾。经香连丸低、中、高剂量干预的UC小鼠结肠组织中MDA表达下降,SOD、GSH-Px活性增加,抗氧化能力得到增强。自噬方面,Beclin1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调,LC3Ⅰ蛋白表达下降,表明香连丸可能通过促进自噬和降低氧化应激反应,改善结肠损伤,促进组织修复[43]。

4.2 激活线粒体自噬

线粒体自噬可被氧化应激激活,且线粒体自噬可减少氧化应激。在苗金雪等[44]的实验研究中,黄芩汤可通过激活人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素连接酶(Parkin)自噬通路,启动线粒体自噬,清除组织内受损的线粒体,缓解UC大鼠的氧化应激反应。地马煎剂由芍药汤化裁而成,是查安生教授治疗UC的经验方,能够有效控制轻、中度UC活动。在王睿等[45]的研究中,地马煎剂组大鼠结肠组织中腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1Binte racting protein3,BNIP3)、Beclin1、LC3蛋白相对表达均增高,研究提示地马煎剂可通过缺氧诱导因子1α/BNIP3/Beclin1通路,激活线粒体自噬对抗UC炎症反应。BNIP3是线粒体自噬的正向调控通路中的关键蛋白,后期实验中地马煎剂各剂量组黏膜组织BINP3蛋白及BNIP3 mRNA表达均升高,提示线粒体自噬水平得到增强,促进了肠道炎症修复[46]。

5 结语

中医药治疗UC有着确切的临床疗效。通过以上对近年来国内外基于细胞自噬调控的中药治疗UC药理机制研究进展的总结,可以发现中药单体(或其活性成分)和复方制剂能够通过调控自噬相关蛋白表达进而调控自噬通路从而发挥治疗UC的作用,其主要作用靶点集中在Beclin1、p62、LC3、炎性细胞因子和其他作用相关蛋白,主要作用信号通路有AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR、Akt/mTOR、SIRT1/mTOR、NF-κB及PINK1/Parkin等信号通路。随着对细胞自噬调节机制研究的深入和认识,应注意到自噬具有双重调节作用,自噬太过与不足皆会影响UC进展,在疾病治疗上需要深入研究是应该诱导自噬还是抑制自噬。同时,目前尚缺少基于细胞自噬调控治疗UC的临床研究。因此,进一步分析中药对细胞自噬影响机制以及研究中药在UC中发挥药理作用的具体机制十分必要。