艾灸治疗排卵障碍性疾病的作用机制研究概述

付雅琪 魏伟峰 胡小芳

我国不孕症的发病率已从2007年的12%升至2020年的18%[1],其中排卵障碍作为不孕症常见因素占女性不孕的25%～35%。排卵障碍成因机制复杂,与遗传、内分泌、免疫、环境、炎症反应等因素相关。临床治疗本病以药物促排卵为主要手段,艾灸作为传统的中医非药物疗法,在治疗排卵障碍性疾病上有着确切的临床疗效。随着近年相关动物实验及临床试验的深入开展,艾灸治疗本病的机制已取得一定的研究进展,本文就艾灸治疗本病的机制研究进展进行评述。

1 调节内分泌激素水平

1.1 艾灸调节生殖相关激素水平

1.1.1 艾灸调节下丘脑-垂体-卵巢轴 卵泡的生长发育及排出是一个机体内外各因素综合调控的结果,其中起关键调控作用的是下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPOA)。HPOA能够通过调控下丘脑、垂体及卵巢功能,影响促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、黄体生成激素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)及雌、孕激素的分泌释放,从而形成周期性的规律排卵。若以上激素分泌量、分泌周期失常,或正负反馈机制紊乱,都有可能会造成卵泡发育不良或排出障碍[2]。

李娜等[3]通过观察逆针灸“关元”对去卵巢大鼠的影响,发现逆针灸关元穴能够不同程度升高雌二醇、雌激素受体和GnRH水平,并降低FSH和LH水平,提示了艾灸能够调节去卵巢大鼠HPOA的紊乱,恢复大鼠内分泌水平,对于治疗卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)所导致的排卵障碍性疾病有积极的治疗作用。

1.1.2 艾灸调节抗缪勒氏管激素水平 由小卵泡颗粒层细胞分泌的抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH)能够抑制始基卵泡的募集,降低原始卵泡的消耗,从而保留卵巢的储备功能,其水平高低能够反映卵巢的储备功能,且不受月经周期的影响[4]。

金洵[5]对DOR模型的大鼠进行了不同时间的艾灸干预,并观察干预前后大鼠血清激素水平变化,发现艾灸能够有效提升大鼠的AMH水平,降低FSH、雌二醇、雄激素及脱氢表雄酮含量,改善大鼠动情周期及卵巢指数,说明艾灸预处理对DOR模型大鼠的卵巢储备功能有一定改善作用,但艾灸介入时间不同,干预效果不同。

1.1.3 艾灸增强前列腺素受体的表达 前列腺素(prostaglandin,PG)作为局部作用的脂质信号,在调节女性生殖,包括卵母细胞发育方面起重要作用。其中PGE2能够保护卵母细胞免受氧化应激,减少卵丘-卵母细胞复合体中的细胞凋亡,还能够与PGF2α一起通过影响血管紧张素II水平介导卵母细胞减数分裂成熟,从而促进排卵[6-7]。

章庆庆[8]通过观察艾灸关元穴对寒凝证痛经大鼠子宫的影响,发现在艾灸早期干预的作用下,痛经大鼠子宫血流微循环增加,子宫组织中前列腺素相关受体表达及PGE2/PGF2α比值状态得到显著改善。说明艾灸能够通过增强前列腺素受体表达,调节PGE2、PGF2α的分泌异常,改善子宫微循环状态,从而使子宫及卵巢内环境恢复平衡,促进卵泡发育及排出。陈盼碧等[9]对痛经大鼠艾灸后的PG水平观察结果也间接证实了这一观点。但对于艾灸调控PG水平对卵巢的直接作用的相关基础研究文献暂不充分。

1.2 艾灸调节甲状腺激素水平

甲状腺功能与女性生殖健康联系密切,甲状腺功能减退会引起卵泡发育不良及卵巢萎缩,影响正常排卵从而导致不孕结局的发生。其机制可能与甲状腺激素通过影响甲状腺激素受体干预卵巢内分泌功能,导致生殖性激素水平紊乱有关[10]。

康春嵋等[11]通过ELISA法测定甲减大鼠甲状腺激素的水平,观察艾灸对甲状腺功能及形态的影响。实验结果示艾灸治疗后甲减大鼠的体质量及总三碘甲状腺原氨酸、总甲状腺素水平显著升高,促甲状腺激素水平及甲状腺滤泡上皮细胞增殖抑制率和凋亡率显著下降,说明艾灸能够有效调节甲状腺激素水平,促进甲状腺滤泡上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,恢复原有甲状腺组织结构与功能,从而矫正HPOA调节失常,恢复排卵及妊娠。

1.3 艾灸调节肾上腺皮质激素水平

多数研究表明,肾上腺皮质功能异常时可以对雌性生殖产生多层次的不利影响。如在应激条件下,下丘脑释放促皮质激素释放激素(corticotrophin releasing hormone,CRH),CRH的升高能够通过激活Fas/FasL系统触发卵巢细胞凋亡并损害卵母细胞能力[12],并刺激垂体释放促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),ACTH再刺激肾上腺皮质释放皮质激素,升高的肾上腺皮质激素可抑制下丘脑和垂体,抑制促性腺激素的分泌及其对卵巢的刺激作用,导致女性男性化和无排卵[13]。

Wang SJ等[14]发现艾灸可以通过促进糖皮质激素,糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors,GR)和GR蛋白表达的结合来调节应激反应,降低CRH和ACTH过表达的反馈抑制。雷菲等[15]通过对亚急性衰老大鼠皮质酮及GR水平的观察,发现艾灸能够降低衰老大鼠模型的血清皮质酮水平,并上调胸腺GR含量,减轻因衰老产生的对性腺和免疫功能的抑制,其机制可能与皮质酮通过CORT-Nr3c1-AP1/Creb轴抑制糖皮质激素中的黄体生成素受体表达,诱导无排卵的发生有关[16]。以上研究说明艾灸可以调整肾上腺皮质激素的分泌及释放,减少CRH、ACTH、皮质酮等相关激素对HPOA的异常反馈,促进下丘脑及垂体生殖激素的分泌,从而促进卵泡的发育及成熟。

2 调控氧化应激及卵巢颗粒细胞凋亡

颗粒细胞凋亡被认为是引起卵泡闭锁的重要机制[17],其数量能反映卵巢衰老程度,与卵巢储备功能下降密切相关。氧化应激生成的高水平活性氧能够影响卵泡颗粒细胞相关转录因子的表达和转录,诱导凋亡和自噬下游相关基因的表达,引起颗粒细胞凋亡和自噬,最终导致卵泡闭锁[18]。艾灸可以通过调节相关因子基因蛋白的表达,抑制氧化应激引起的颗粒细胞凋亡,从而改善因卵巢功能衰退导致的排卵障碍。

2.1 艾灸调节BcI-2、Bax表达水平

B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2关联X蛋白(Bel-2 associated,Bax)作为一对正负调节基因,是颗粒细胞凋亡过程中重要的因子。一般认为Bax等主要诱导细胞凋亡,而Bcl-2等则抑制细胞凋亡[19]。

卢岩[20]通过对卵巢早衰模型大鼠的研究,发现了脐灸可能通过上调卵巢早衰模型大鼠卵巢Bcl-2和下调Bax的表达,促进卵巢颗粒细胞分裂、抑制其过度凋亡,修复卵巢功能,最终改善排卵。

2.2 艾灸调节半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶表达水平

半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)是执行细胞凋亡的关键酶,其活化后可以启动相关蛋白酶的分子级联反应,放大凋亡信号,迅速导致细胞死亡[21]。

沈洁等[22]通过观察艾灸预处理对早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)大鼠生育力的影响,发现艾灸能够升高POI大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白及mRNA表达,有效抑制POI大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡,从而改善卵巢功能。

2.3 艾灸调节Nrf2/HO-1/NQO-1 mRNA及蛋白表达

核因子E2相关因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO-1]是调控机体氧化还原反应的关键因子。Nrf2介导的氧化应激在女性生殖系统疾病中具有重要作用,能够调控细胞内多种抗氧化基因的表达[23]。当细胞内氧化或抗氧化体系失衡时,活化的Nrf2与抗氧化元件结合,激活下游的NQO-1和HO-1等蛋白质的表达,从而维持细胞氧化或抗氧化平衡,对细胞起到保护作用[24]。在对多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者的治疗中,激活Nrf2信号传导可通过减轻胰岛素抵抗和氧化应激,改善PCOS大鼠卵巢组织的损伤[25]。

Yang X[26]通过观察艾灸对自然衰老卵巢中的细胞凋亡和抗氧化防御的影响,发现艾灸能够通过上调抗氧化应激相关基因HO-1和NQO-1的mRNA和蛋白表达水平,下调Bax/Bcl-2的比例来抑制卵巢细胞凋亡,并能缓解卵巢纤维化,降低衰老标志物表达,增加卵巢功能激素分泌,从而有效改善卵巢功能。汪倩[27]通过观察艾灸对DOR大鼠Nrf2/HO-1信号通路的影响,发现艾灸能够通过与调控Nrf2/HO-1信号通路来降低DOR大鼠的动情周期紊乱率,改善血清性激素水平和抗氧化应激能力,抑制细胞凋亡,恢复卵巢功能,达到雌激素替代治疗的效果。

2.4 增强卵巢颗粒细胞线粒体活性

线粒体作为细胞质中最重要的细胞器之一,除细胞的增殖和代谢提供所需的能量外,还可以调控抗氧化、细胞凋亡及自噬等重要生理过程[28],线粒体活性与颗粒细胞的抗氧化能力有直接关联[29]。

方育恩等[30]运用针灸联合补肾中药辅助治疗30例接受辅助生殖技术治疗的DOR肾精亏虚证患者,并检测患者抗氧化应激相关基因及卵巢颗粒细胞线粒体活性。实验结果示针药结合疗法能有效提高注射HCG日血清雌二醇、孕激素水平,升高卵泡液谷胱甘肽过氧化物酶含量,增强卵巢颗粒细胞线粒体活性,取得更高的优胚率并降低取消移植率。

除此外艾灸还能够通过调节影响颗粒细胞凋亡的相关激素及细胞因子(如类固醇激素、GnRH、促性腺激素、类胰岛素样生长因子等)抑制颗粒细胞凋亡,从而减缓卵巢衰退进程。

3 调节卵泡液中的细胞因子

卵泡液作为卵母细胞赖以生长和发育的微环境,其中含有丰富的细胞因子,如一氧化氮、瘦素、干扰素、肿瘤坏死因子、白介素等,这些细胞因子能够直接或间接地影响着颗粒细胞的有丝分裂与卵母细胞的发育成熟,从而影响排卵功能。

3.1 艾灸调节炎性因子的表达

卵泡液中的炎性细胞因子,如干扰素γ、肿瘤坏死因子α和白介素等的异常升高能够激活体内抗卵巢自身免疫应答,造成卵巢细胞损伤、卵泡过度闭锁[31]。艾灸的温通效应能够抑制炎性细胞因子的表达,缓解机体炎症反应。其机制大概与灸温下瞬时受体电位香草酸亚家族的激活,及后续生长因子的促进、炎性调节因子等活性物质生成有关[32]。

张彩荣[33]等使用ELISA法测定经艾灸治疗后的卵巢早衰大鼠的血清性激素及炎性因子含量,Western blot法测定卵巢组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)含量及磷酸化水平,发现予卵巢早衰大鼠艾灸“关元”“三阴交”处理,可以能够显著降低血清中LH、FSH、白介素6、白介素1β含量,增加雌二醇含量,降低卵巢组织磷酸化PI3K、Akt、mTOR的表达水平,改善卵巢组织出现的病理损伤,提示艾灸可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化调节炎性因子的表达,改善大鼠卵巢早衰状态。

3.2 艾灸调节瘦素及胰岛素样生长因子1在生物体内的含量

瘦素和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在卵泡发育和繁殖中起协同调节作用。IGF-1作为生长发育必备的生长因子,能够协同促性腺激素调节,参与卵泡的生长发育及优势卵泡的选择。研究表明瘦素能够增加IGF-1,IGF-1受体和胰岛素样生长因子结合蛋白-2的mRNA表达,并减弱卵巢中AMH基因表达,从而促进原始卵泡发育,消耗卵泡池储备,导致卵巢功能的减退[34]。

莫捷[35]对12个月龄的自然绝经期大鼠进行了逆针灸关元穴的研究,发现逆针灸能够有效提高更年期大鼠的体重质量,减少下丘脑及卵巢中的瘦素含量,通过改善更年期大鼠瘦素抵抗的状态,在一定程度上延缓更年期卵巢功能的减退。林净[36]通过观察艾灸对肾阳虚证PCOS患者血清激素水平及IGF-1的影响,发现隔药灸及温灸器均能改善患者LH、FSH以及LH/FSH比值,并能明显降低患者血清IGF-1水平,缓解肾阳虚临床症状。以上研究证明了艾灸能够通过调节瘦素及IGF-1水平有效治疗卵巢功能减退、PCOS等排卵障碍性疾病。

3.3 艾灸增强一氧化氮的合成

研究证明一氧化氮广泛存在与哺乳动物的子宫肌、卵巢中,其能够通过影响下丘脑和垂体水平的作用来调控生殖活动,包括促进卵母细胞的减数分裂和成熟,影响卵泡的生长发育、排卵和闭锁,甚至影响胚胎着床、发育及分娩,其作用几乎贯穿整个生殖过程[37]。

李晓泓[38]使用逆灸关元穴治疗了56只自然更年期雌性大鼠,发现逆灸能够通过增强各月龄组大鼠子宫的超氧化物歧化酶活性,促进一氧化氮合成,改善更年期应激状态引起的卵巢功能减退及其引起的子宫靶器官的结构损伤。

4 改善卵巢血液微循环

卵巢内血管系统的维持和持续生成为卵泡发育和黄体建立提供营养、氧气和激素支持,并随着卵泡的募集与排出发生周期性的生成和退化。当卵泡所需供氧不足时,会造成卵泡发育速度减缓,卵子质量下降,从而导致排卵功能障碍[39]。

4.1 艾灸改善卵巢动脉血流参数指标

据相关研究显示,拥有正常月经周期的女性的卵巢动脉血流呈周期性变化,若血流灌注良好,则可为卵泡生长发育提供有利条件,临床常使用经阴道彩色多普勒超声监测卵巢动脉血流参数以评估卵泡发育状况。血管阻力指数(resistive index,RI)、搏动指数(pulsatility index,PI)、舒张末期流速(end diastolic velocity,EDV)、卵巢血流收缩期峰值流速(peak systolic velocity,PSV)是超声评估卵泡发育的4个重要指标,其中排卵障碍患者PSV、EDV呈异常降低趋势,PI、RI呈显著升高趋势[40-41]。

刘穗[42]通过观察针灸治疗后卵巢储备功能下降患者子宫、卵巢形态及血流动力学参数,发现针灸能够有效升高卵巢基质动脉和子宫内膜及子宫内膜下螺旋动脉PSV、EDV、子宫动脉收缩期与舒张期流速比,降低卵巢基质动脉RI、子宫内膜及子宫内膜下螺旋动脉RI水平,改善卵巢及子宫动脉血流,提高基础窦卵泡数目和卵巢体积,缓解局部症状,恢复排卵能力。

4.2 艾灸调控血管内皮生长因子的表达

血管内皮生长因子是一类由多个亚型及受体组成的复杂蛋白,血管内皮生长因子系统的成员影响内皮和非内皮细胞的增殖、存活和迁移,参与调节卵泡血管的生成和发育。次级卵泡产生的血管内皮生长因子能够直接作用于卵泡细胞,促进卵泡血管的生成及下游窦状突的形成,刺激窦前卵泡发育[43]。

卢岩[44]通过对卵巢早衰模型大鼠的观察,发现艾灸神阙穴能够通过上调血清中血管内皮生长因子、AMH及雌激素含量,促进内皮细胞的增殖和游走、增加血管的通透性,促使卵巢周期性血管新生,改善卵巢血供,对卵巢早衰大鼠的卵泡数量及卵巢储备功能均有明显的促进作用。

5 改善卵巢组织形态

卵巢功能逐渐减退,体内雌激素水平低下,可影响其效应器官,即子宫和卵巢形态功能发生改变。研究显示相较于正常卵巢,POI患者卵巢结构模糊且体积变小、存在低回声、内部出现纤维条状、卵泡数量减少且体积变小[41]。

解秸萍[45]观察了逆灸治疗后更年期大鼠的生殖内分泌及免疫功能状态,发现逆针灸能通过对内分泌-免疫网络双向调节改善更年期机体状态,不仅能够改善大鼠的内分泌激素水平、增强免疫功能,还能够逆转更年期卵巢萎缩和纤维样变、卵巢动静脉血退行性病变等组织的衰退或下调。

6 讨论

艾叶药性辛温,能通十二经,入三阴,有温肾散寒、活血通络的功效。艾绒燃烧产物所具有的多种有效成分能够抑制炎性介质的释放,发挥提高机体免疫力及抗炎功能[46],减少因炎症损伤带来的卵巢细胞损伤及卵泡过度闭锁。而灸法所具有的温通效应可以促进血液循环,提高机体代谢能力[32],增加卵巢局部血流量,改善卵巢缺血、缺氧状态;在艾灸燃烧时,其所辐射的近红外光谱能够为细胞代谢和免疫功能提供所需能量、传递生物信息,还可以激活老化、病态的细胞,抑制细胞凋亡[47]。综上所述,艾灸治疗排卵障碍的作用机制涉及了艾叶的辛温发散的药性、光辐射效应、温通效应、艾绒的燃烧化合物的综合作用,能够提高患者卵巢功能,改善卵子质量及子宫内膜容受性。

目前对艾灸治疗排卵障碍性疾病的起效机制研究比较完备,但仍存在一些不足:(1)机制研究多集中在艾灸通过对HPOA及AMH等激素的影响以调节卵巢功能,对影响卵泡发育的一些蛋白及代谢物,如同型半胱氨酸、乳铁蛋白、游离脂肪酸等,缺少直接的实验研究;(2)临床研究文献质量参差不齐,艾灸的种类、施治时间、取穴及疗效判定标准尚未统一,文献真实性存疑。日后研究需要更加注重文献质量及目前缺少的作用机制的探讨,为艾灸治疗排卵障碍性疾病的临床应用提供可靠参考。