腰果CBF基因家族的鉴定及响应冷胁迫的表达模式

崔恒久 曾教科 李雯 黄海杰 彭世清 郭冬 蒲金基 周永凯 李辉亮

关键词：腰果；低溫响应；CBF 转录因子；基因家族；qRT-PCR

植物生长受多种环境因素的控制，其中温度是重要的因素之一[1]。低温胁迫会影响甚至破坏细胞的动态平衡，导致植物生长发育受到严重影响[2]。C-repeat binding factor（CBF）转录因子，也叫做dehydration responsive element binding factor1蛋白（DREB1 蛋白）[3-4]，在响应低温胁迫中起重要作用，冷应答途径是植物感受低温信号重要的调控途径之一。ICE-CBF-COR 是被研究最透彻的一条通路。植物对低温等非生物胁迫抗性的提高与脯氨酸、可溶性糖等物质的积累密不可分，而相关物质的积累需要下游基因的激活表达。下游基因的激活表达需要CBF 转录激活因子与下游COR 基因启动子中的DRE/CRT （C-repeat/dehydration responsiveelement）顺式作用元件特异性结合[5-8]。

CBF转录因子属于Apetala2/Ethylene responsivefactor 基因家族（AP2/ERF 基因家族），AP2/ERF由AP2 亚家族、ERF 亚家族和RAV 亚家族组成。目前，CBF 基因家族已经在多种植物中得以研究，拟南芥（Arabidopsis thaliana）研究表明，拟南芥基因组中含有6 个CBF 基因[9]。此外，CBF/DREB1转录因子还存在于其他植物中，如番茄[10-13]、水稻[14-20]、大豆[21-25]等。CBF/DREB1 转录因子具有高度保守的AP2/ERF 结构域。AP2/ERF 结构域含约60 个氨基酸[26]。

腰果（Anacardium occidentalie Linn）被誉为世界四大著名坚果之一。是典型的热带果树，原产地在巴西东北部地区，16 世纪被引入亚洲、非洲以及南美洲的热带国家和地区[27]。栽培的纬度范围在北纬20°和南纬20°之间，但主要分布在15°以内地区。我国腰果种植主要集中在云南、海南等地。

腰果仁有丰富的营养价值，用途十分广泛，可作为甜品、点心、菜肴的原材料。副产品主要有果梨、果壳液等，果壳液被作为重要的工业原料被大量使用，果梨可以食用，用在果酒、果酱、腌菜等[28]。因此，种植腰果可以带来很大的经济效益、社会效益和生态效益。在中国热带地区脱贫攻坚和乡村振兴中起到重要作用。腰果对低温比较敏感，当温度低于15 ℃时生长缓慢，在8 ℃时受到严重伤害，此前，海南等地的腰果因低温受灾严重。目前，对腰果的研究主要集中在生理层面，对于分子层面的研究较少。抗逆基因已经在许多物种中进行了挖掘和应用，本研究将腰果作为实验材料，对腰果的CBF 基因家族进行相关生物信息学分析，分离鉴定得到AoCBF 基因，为后续深入开展腰果耐寒性研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

将保存于中国热带农业科学院种质库的腰果种质资源CJSX 作为实验材料。通过筛选得到有活力的种子，将筛选的种子进行催芽，长出真叶后移栽至育苗盘中，在温度为25 ℃，16 h 光照，2800 lx 的环境下生长。生长到6 片真叶时，移栽至人工气候屋，保持光照条件不变，对照温度25 ℃（CK）不变，温度分别调至8 ℃、16 ℃，2个温度下处理时间为6 h、24 h，共4 个处理（T1：8 ℃ 6 h，T2：8 ℃ 24 h，T3：16 ℃ 6 h，T4：16 ℃24 h）。将低温处理过的腰果叶片采摘，液氮处理，送公司进行Illumina 转录组测序。

1.2 方法

1.2.1 腰果CBF 基因家族的鉴定和分析 在拟南芥资源网站TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）上获取相关AtCBFs 蛋白序列。将得到的AtCBFs蛋白序列进行本地BLAST 分析， 相关参数E_value 设置为10e–50；蛋白的筛选标准为identity≥60%，align_ratio≥60%。将蛋白是否含有AP2结构域作为重要的判断依据，使用NCBI-CDD 数据库与Pfam_scan 软件进行验证，由此得到具有AP2 结构域的候选腰果CBF 基因。利用在线软件Expasy（ https：//web.expasy.org/protparam/）分析腰果AoCBF 蛋白序列，对每个AoCBF 蛋白的等电点、长度、相对分子质量进行预测[29]。使用Cell-PLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在线软件对候选的腰果CBF 基因进行亚细胞定位预测[30]。

1.2.2 AoCBF 蛋白保守结构域和保守基序（motif）分析 对每个AoCBF 氨基酸序列使用MEGA-X软件进行比对，使用MEME 在线软件（https：//meme-suite.org/meme/）对AoCBF 蛋白保守结构域对进行分析。对相关AoCBF 蛋白的保守基序进行分析[31]，设置为5 个基序，设置基序为10～200个氨基酸长度，其他参数均为默认值。使用SWISS软件对AoCBF 蛋白进行三维结构预测[26]。

1.2.3 AoCBF 蛋白系统进化分析为了进一步研究腰果和拟南芥之间的进化关系，将6 个AoCBF 蛋白和6 个AtCBF 蛋白采取Neighborjoining（NJ）法在MEGA-X 软件上构建系统发育树[24]，Bootstrp method 参数值设为1000。

1.2.4 AoCBF 基因上游序列的顺式作用元件分析从 JGI（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Aoccidentalev0_9）网站上获取AoCBF 基因上游2000 bp 的序列，利用PlantCARE 软件对其进行顺式作用元件预测分析[32]。

1.2.5 AoCBFs 在冷脅迫下的表达模式 用TBtools（v1.082）软件提取转录组数据库中腰果CBF 基因家族的CDS 序列，并通过IDT（https：//sg.idtdna.com/pages）在线网站进行引物设计（表1）。使用多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（成都福际生物技术有限公司）按照说明书从每个样品中提取总RNA，并对其浓度和纯度进行检测，结果显示A260/A280 和A260/A230 的参数均在2.0 左右，表明RNA 无明显的DNA 和蛋白污染，此外，通过琼脂糖电泳也检测RNA 的完整性。随后通过逆转录试剂盒（苏州莫纳生物科技有限公司）按照说明书合成cDNA 第一链并检测其浓度，稀释后备用。并使用2–ΔΔCT 方法计算每个AoCBFs 的最终相对表达水平。使用GraphPad Prism 8 软件制图，每个处理3 个生物学重复。

2 结果与分析

2.1 腰果CBF 基因家族成员的鉴定和分析

用转录组数据库和6 个已知的拟南芥AtCBFs序列进行本地BLAST 分析，共得到15 个注释的DREB 基因。经过结构域分析，鉴定出11 个腰果CBF 基因。设计特异性引物进行PCR 扩增，获得6 条腰果序列（AoCBF1～AoCBF6）。

理化性质分析结果显示，AoCBFs 编码的氨基酸序列存在较大差异，预测蛋白的长度为189～334 aa，最长的为AoCBF1，最短的为AoCBF4。蛋白分子量介于21.31～37.89 kDa 之间；6 个AoCBFs全部呈酸性，其理论等电点（pI）介于4.93～5.79之间。通过亚细胞定位分析得出所有AoCBFs 都有核定位信号（表2）。

2.2 AoCBF 蛋白保守基序分析

保守基序（motif）预测结果表明（图1），AoCBFs 含有5 个保守motifs。motif 1、motif 2存在所有AoCBFs 中，表明2 个基序高度保守。AoCBF1只包含motif1、motif2，AoCBF2、 AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 包含motif1、motif2、motif3、motif5，原因可能是串联重复过程中碱基丢失造成的。对上述保守基序检测发现motif 1 含有AP2 结构域。根据其在结构上有所不同，推测不同AoCBF 在功能上存在一定差异。

2.3 腰果和拟南芥CBF 蛋白的系统发育树分析

将6 个AoCBFs 氨基酸序列和6 个AtCBFs氨基酸序列构建系统发育树。结果显示，上述CBF氨基酸序列可分成A、B 两个亚家族。AoCBFs在A 组有1 个，B 组有5 个。AtCBFs 在A 组有2个，B 组有6 个（图2）。

2.4 AoCBFs 三维结构及序列特征分析

6 个AoCBF 蛋白序列相似性在46%～58%之间。一段长度为60 个氨基酸左右较为保守的序列在N 段被发现，软件预测其为CBF 蛋白的DNA结合结构域（图3）。AoCBFs 的identity 最高为AoCBF4 和AoCBF6。最高的同源性为58.21%。对AoCBFs 进行三维结构建模分析，1 个α-螺旋和2 个β-折叠构成AoCBFs 的三维结构。

2.5 AoCBFs 上游序列的顺式作用元件分析

利用PlantCARE 软件注释AoCBFs 基因上游2000 bp 启动子区域序列，在其上游发现了参与激素反应的相关顺式作用元件（茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸有关的顺式作用元件）、参与低温、干旱和高盐诱导胁迫相关的响应元件、光响应元件。此外，普遍存在于启动子与增强子区的核心元件、生长发育相关调控顺式作用元件也被发现。结果表明，AoCBF 基因在抵御非生物胁迫、生长发育、激素调控中发挥重要作用（表3）。

2.6 AoCBFs 在冷胁迫下的表达模式

为了探明AoCBFs 在冷胁迫下的表达模式，对AoCBFs 进行实时荧光定量PCR 分析。结果表明，经8 ℃和16 ℃低温诱导处理6 h 和24 h 后，除了AoCBF5 在8 ℃时相对表达量变化较少，在16 ℃表达变化较大，其他基因在8 ℃的表达量均显著升高。表明AoCBF 基因参与响应冷胁迫相关生物学过程（图4）。

3 讨论

腰果是典型的热带果树，对低温极敏感。主要在我国热区的海南、云南等地种植。但是近年来冬季寒潮频发，温度降低使腰果受到冷害的问题愈加严重。植物中CBF 家族在面对低温时发挥调控作用，减少低温对植株的损伤。因此，本课题组对腰果CBF 家族进行生物信息学分析，以期发现腰果CBF 基因在低温胁迫下的调控机制。

本研究共鉴定获得6 个AoCBF 基因。并对其理化性质、亚细胞定位、系统发育进化树、蛋白三维结构、顺式作用元件以及对低温胁迫下的表达方式进行研究。由于AoCBFs 的等电点为4.93～5.79，蛋白呈酸性，故在酸性亚细胞环境下，AoCBF 蛋白可能会发挥作用。AoCBFs 可以分为2 个亚族：AoCBF1 为A 族，AoCBF2、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 为B 族。而B 族中AoCBF3、AoCBF4 具有更高亲缘性，AoCBF2、AoCBF5、AoCBF6 可能具有类似的调控方式。

目前CBF 基因在十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、漆树科植物、茄科植物中均有研究。最早是STOCKINGER 等[33]在模式植物拟南芥中克隆得到相关CBF 基因。拟南芥的6 个家族成员，受外源ABA 诱导的有CBF1、CBF2 和CBF3。CBF1 和CBF3 的表达受CBF2 的负调控。CBF4不能响应低温胁迫诱导但是能够响应干旱和ABA诱导[34]。DREB1E 和DREB1F 均可以受高盐胁迫诱导。本研究在6 个AoCBFs 启动子上不仅筛选到响应低温诱导、干旱诱导、光响应元件有关的顺式作用元件，而且筛选到与茉莉酸、生长素、水杨酸、脱落酸、赤霉素等激素有关的顺式作用元件。后续可开展分子对激素和冷信号调控的相关机制。

AoCBF 基因家族6 个成员均不存在内含子，所以AoCBF 基因为内含子缺失型。内含子缺失型基因在面对胁迫时，可通过减少转录处理的方法提高转录本积累的效率[35]。

本研究发现，腰果经过冷胁迫处理后，6 个AoCBF 基因均对低温产生响应，除了AoCBF1、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5 在16 ℃表达显量著提高，其余的基因均在8 ℃时表达量显著提高。

相较于传统的杂交育种、诱变育种等方式，基因工程技术有高效率、短周期、提高植物抗逆性等优势。科研工作者可以利用基因克隆技术、基因重组技术、转基因技术等基因工程技术提升植物抵御低温胁迫的能力。本研究通过对AoCBF基因家族进行生物信息学分析，分析AoCBF 基因在低温胁迫下的调控机制，为未来的腰果抗性分子辅助育种研究工作奠定基础。