RNA干扰Slug基因表达抑制胰腺癌侵袭转移的实验研究*

柳湘洁,宋彩霞,张群声,王启全

(1.贵州省电力医院干医科,贵阳 550002;2.山东省胶南市人民医院内科 266400;3.海南省海口市人民医院消化内科 517010)

胰腺癌具有隐匿性和高度侵袭性特点,因此早期即可发生转移。传统的治疗方法效果差,且不能控制胰腺癌肿瘤的生长和浸润转移,也不能显著延长患者的中位生存时间,因此需要探索新的胰腺癌治疗方法,而基因治疗被寄予厚望。

多个研究报道,Slug基因在多种恶性肿瘤中存在明显上调,Slug上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后[1-7]。Hotz等[8]新近发现,胰腺癌组织及高转移潜能的胰腺癌细胞株存在Slug的明显上调。本研究推测干扰Slug能抗胰腺癌转移作用。基于上述理论,本课题旨在研究Slug干扰对胰腺癌侵袭、转移的影响,为抗胰腺癌转移提供新的基因靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI1640购于Hyclon公司,小牛血清购于杭州四季青公司,胰酶为国产。质粒提取试剂盒购于AXYGEN,连接试剂盒 RNA提取试剂、cDNA合成及 PCR扩增试剂、G3PDH购于TaKaRa;Lipofectamine购于INVITROGEN,质粒提取试剂盒购于AXYGEN,Millicell(小室)由MilliPore公司生产,M atrigel和6孔板购于美国BD公司。Slug-shRNA-1和shRNA-1质粒由海口市人民医院王齐全教授惠送,兔抗人多克隆抗体Slug购于SANTACRAUZ公司。

1.2 细胞株和裸鼠 PANC-1胰腺癌细胞株购于中国科学院上海生物研究所细胞库,细胞用含 10%胎牛血清的RPM R1640培养基培养,细胞培养条件为37℃恒温,饱和湿度为5%CO2,指数生长的细胞为实验对象。取4周龄健康纯种BA LB/c-nu/nu雌性裸鼠,体质量 18～22 g,在海南医学院动物实验中心SPF级饲养,称重,编号。实验对象共分为3个组:pSlug-siRNA组、空白对照组和pNeg-siRNA组。

1.3 方法

1.3.1 基因转染及稳定表达细胞株的筛选 PANC-1细胞在含有10%小牛血清的DMEM培养基中,37℃、5%CO2条件下培养。用0.25%的胰酶消化细胞后,按每孔4×104个细胞均匀加入96孔板中,培养至细胞85%～90%汇合后,分别转染pSlug-siRNA和pNeg-siRNA质粒,具体操作按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行。转染24 h后将细胞以1∶10比例传代,次日开始用含有 500 μ g/mL G418的培养基进行筛选培养,每3天更换一次培养基,连续筛选3周,然后将获得的细胞克隆,扩大培养。

1.3.2 RT-PCR测定Slug-shRNA-1作用PANC-1细胞后Slug mRNA表达 按 TRizol试剂盒(Invitrogen公司)说明书操作提取稳定转染pSlug-siRNA、pNeg-siRNA的细胞和空白对照组细胞总RNA,取1 μ g RNA模按RT试剂盒说明书反转录得到cDNA。引物序列 Slug(156 bp),R:5′-GCA GAC GAC GGG TCA GAT-3′,F:5′-GAC TGA CCC GTC GTG ACG-3′;反应条件:50℃30 min,94℃2 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,72℃延伸7 min,28个循环。取5 μ L反应产物在含 EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用SYNGENE型凝胶成像系统照像,以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。试验重复3次,数据以表示。

1.3.3 Western-blot测定Slug蛋白表达 提取细胞总蛋白进行Western-blot检测:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶浓度为12%,积层胶浓度为5%,上样量为15 μ g/L;SDS电泳:恒流,每块板20～40 mA,电泳时间约2 h;转膜:恒流,每张膜42 mA,时间 3.5 h。

1.3.4 体外侵袭实验 将matrigel按每孔 40 μ L均匀地铺在millicell膜上,37℃成胶30 min,置紫外灯照射过夜,实验前再次成胶30 min。待培养的肿瘤细胞达80%饱和度时,消化、计数,取不同处理组细胞2.0×10个,分别接种到成胶的millicell内,将millicell小室置于24孔板内,用含10%BS的RPMI1640培养液培养48 h。培养48 h后,取出millicell用棉头擦掉matrigel,少量磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,95%的乙醇固定15 min,HE染色,揭下 millicell膜反贴在载玻片上。结果判定:在200倍光镜下,每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数,并计算每个视野的平均穿膜细胞数。

1.3.5 建立模型 取处于对数生长期的 3个组细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,离心去上清液后用 PBS重悬细胞,以MTT测定细胞活力在95%以上,调整细胞浓度为 5×106/mL。用带有6号针头的注射器吸取100 μ L细胞悬液,接种于裸鼠右背皮下,常规饲养。待3周后肿瘤形成并长至一定体积时,无菌条件下切取肿瘤组织,剪成10 mm3大小的组织块,生理盐水漂洗后接种在裸鼠脾窝或胰腺表面,固定。每只3块,观察8周,每组10只。

1.3.6 观察指标 观察裸鼠的一般情况,摄食,活动能力。8周后CO2吸入法处死裸鼠,观察腹腔肿瘤的转移情况以及肿瘤的生长情况。

1.4 统计学方法 应用SPSS10.10软件进行统计学分析,实验结果用表示,采用 t检验。

2 结 果

2.1 稳定转染后细胞中Slug mRNA表达的变化 空白对照组、pNeg-siRNA、pSlug-siRNA组细胞Slug mRNA表达水平分别为0.826±0.040、0.812 ±0.042、0.147±0.010,差异有统计学意义(P＜0.05),说明 pSlug-siRNA组细胞Slug mRNA表达被有效沉默,见图 1。

2.2 Western-blot检测 空白对照、pNeg-siRNA、pSlug-siRNA组细胞Slug蛋白表达水平分别为 0.742±0.035、0.710±0.038、0.103±0.000,差异有统计学意义(P＜0.05),说明pSlug-siRNA组细胞Slug表达被有效沉默(图2)。

图1 稳定转染后不同组细胞中Slug mRNA表达的变化

图2 Western-blot检测Slug表达

2.3 细胞侵袭实验检测 pSlug-siRNA组穿透基底膜细胞数(35±10)明显少于空白对照组穿膜细胞数(228±71)及pNegsiRNA组穿膜细胞数(219±72),差异有统计学意义(P＜0.05),空白对照组穿膜细胞数与pNeg-siRNA组穿膜细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),见封2图 3。

2.4 Slug干扰抑制腹腔种植瘤生长和转移 3个组裸鼠建立自发转移模型后2周,可以在裸鼠腹部逐渐扪及肿块,开始时肿块小、约1 mm大小,质地硬,活动度大。随着时间延长,pNeg-siRNA组和空白对照组裸鼠腹部肿块逐渐增大增多,部分肿块融合成块而固定不动,向腹腔外突出。从第5周开始,腹腔逐渐出现腹水,并逐渐增多,晚期表现为大量腹水。第8周开始,裸鼠出现摄食减少、进行性消瘦、行动迟缓、反应迟钝及嗜睡的表现。相对而言,pSlug-siRNA组裸鼠腹部肿块增长速度缓于空白对照组和pNeg-siRNA组,腹部触摸肿块数目较少,融合肿块较少,部分裸鼠处死时没有出现腹水,消瘦程度也较轻。开腹后可见pNeg-siRNA组有4只裸鼠发生肝转移,空白对照组有3只裸鼠发生肝转移,pSlug-siRNA组裸鼠无肝转移发生。在腹膜、网膜、肠系膜、肠管、胃壁上有大小不一的灰白色结节,质硬,小于2 mm的结节为圆形,大于3 mm的结节形状不规则,或呈融合状,与周围的组织器官浸润粘连固定,并可见腹水,量不等。3组裸鼠腹腔种植瘤的数目(图4),pSlug

siRNA组裸鼠腹腔种植瘤数目明显少于pNeg-siRNA组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而pNeg-siRNA组和空白对照组裸鼠腹腔种植瘤数目差异无统计学意义(P＞0.05)。3个组裸鼠腹腔种植瘤的腹部外观、肝脏标本、肝转移及消化道标本(封2图5～7,封3图8～9)。3个组裸鼠原位移植瘤重量比较,见图10。

图4 3个组裸鼠自发转移型腹腔种植瘤数目对比

图10 3个组裸鼠原位移植瘤重量对比

3 讨 论

胰腺癌具有隐匿性和高度侵袭性特点,因此早期即可发生转移,而胰腺癌早期症状不典型,确诊时大多已处于晚期,且大多数患者是外科手术不能治愈的,3年生存率不足10%,5年生存率低于5%,迄今为止,胰腺癌仍然是临床治疗最为困难的消化道恶性肿瘤之一。胰腺癌对目前使用的化疗和放疗等治疗方法具有高度的抵抗性,新的药物如Gemcitabine,虽然已经成为中晚期胰腺癌治疗的首选用药,但最终会产生耐药性,上述方法除了能达到减压和减轻疼痛症状的目的外,却不能控制胰腺癌肿瘤的生长和浸润转移,也不能显著延长患者的中位生存时间,因此需要探索新的胰腺癌治疗方法。

肿瘤的基因治疗是针对肿瘤发生的遗传学背景,将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因,从而达到治疗肿瘤的目的,因此,寻找理想的靶基因是肿瘤基因治疗的前提。Slug是转录因子SNAIL家族中编码锌指蛋白的基因,Slug既能下调肿瘤细胞内E-cadherin表达,又能上调细胞内VEGF蛋白表达,因此,Slug与恶性肿瘤血管生成有关。多个研究报道,Slug在多种恶性肿瘤中存在明显上调,Slug上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后[1-8]。尽管某些肿瘤Slug上调不显著,如结直肠癌,但Slug阳性表达与 Dukes分期、远处转移和患者预后明显相关[9]。因此,干扰Slug可能具有抗胰腺癌血管生成和转移作用。

本研究将pSlug-siRNA作用于PANC-1细胞后,Slug的蛋白水平和基因水平都受到明显的抑制,说明Slug基因被有效沉默。本研究用Matrigel模拟基底膜建立体外侵袭模型,通过pSlug-siRNA干扰PANC-1细胞Slug基因后,研究其侵袭和转移能力影响。结果发现,pSlug-siRNA组穿膜细胞数明显低于空白对照组及pNeg-siRNA组,而空白对照组及pNegsiRNA组间差异无统计学意义(P＞0.05),提示 RNA干扰Slug基因可降低胰腺癌细胞的侵袭潜力。

通过体内实验证实,pSlug-siRNA干扰PANC-1细胞Slug基因表达后,实体肿瘤的生长和转移被明显抑制。因此认为Slug与肿瘤的侵袭、转移存在相关性。通过RNA干扰抑制Slug基因的表达可降低人胰腺癌细胞的侵袭转移潜能,抑制胰腺癌肿瘤生长,为胰腺癌基因治疗提供一定的理论基础。

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