野生型p53诱导基因1研究进展*

邹瀛波综述,郭 伟,蒋耀光审校

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军胸外科中心,重庆 400042)

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。过去20多年来,人们对p53基因的认识经历了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的3个认识转变,现已认识到,引起肿瘤形成或细胞转化的突变型p53蛋白是野生型p53基因突变的产物,是一种肿瘤促进因子,它可以抑制正常p53蛋白的功能,而野生型p53基因是一种抑癌基因,它的失活对肿瘤形成起重要作用[1]。

目前研究已经证实,p53可以诱导多种基因的表达,然而到目前为止,研究者尚未发现仅影响p53依赖凋亡途径的单一基因。在野生型p53诱导基因1(wild-type p53-induced gene 1,WIG-1)被发现之前,研究者猜测p53诱导的凋亡可能与一种还未被命名的p53相关基因的表达有关,同样,p53在诸如分化和发育过程中的功能可能依赖于这一特殊基因的调节。之后的研究结果表明WIG-1有可能是影响p53依赖凋亡途径的调节基因[2],因此,对于WIG-1基因的进一步研究,将有可能为阐明p53诱导生理途径的分子机制提供有益的思路和见解。

1 WIG-1的发现

1995年,Leone等[3]通过对J3D小鼠T淋巴瘤细胞周期和凋亡进行研究后发现,在温度敏感的结构中表达的野生型p53(温度敏感p53基因)能够诱导p53阴性的J3D小鼠T淋巴瘤细胞出现G1期停滞和细胞凋亡。p53通过一段特殊序列与DNA结合,并激活带有特殊p53DNA基因的转录子,这种特殊的p53DNA和它们的启动子结合在一起。p53的这种由特殊序列激活的功能对于p53介导的体外生长抑制作用是至关重要的[4]。这些发现表明,特殊的DNA结合序列及其活性对于p53的肿瘤抑制起到了决定性作用。对结果进行进一步分析后发现了一个新的p53诱导的基因——WIG-1,其7.6 kb的和2.2 kb的转录子在温度敏感的p53转染的J3D细胞中的表达是上调的。细胞经γ射线照射后过表达的NIH3T3和p21可以诱导WIG-1的转录。全身γ射线照射可以诱导鼠的脑、睾丸、肾、脾和肺组织 WIG-1表达水平上调,而在未接受γ射线照射的脑、睾丸和肾组织中也可检测到WIG-1的基础表达[4]。进一步的研究表明,WIG-1是一种由p53基因诱导表达的锌指蛋白,在其分子中含有3个锌指结构,WIG-1蛋白中的3个锌指结构能够与特定蛋白、RNA及DNA结合,人类WIG-1与包括小干扰RNA和microRNA在内的不同类型的双链RNA结合后,能够发挥抑制细胞生长的作用[5]。

另外,有研究者发现,用阿霉素等抗肿瘤药物处理携带野生型p53基因的B淋巴细胞,在p53过表达的同时可以检测到WIG-1的表达水平上调[6]。结果进一步表明WIG-1的表达可以由p53诱导,因此,WIG-1是一个p53诱导基因。

目前已发现的WIG-1同源体有:啮齿类动物细胞中的PAG608(p53-activated gene 608,p53激活基因608)和哺乳动物细胞中的ZMA T-3(zinc finger,matrin type 3,锌指基质蛋白3)。PAG608在啮齿类动物所有组织中都可以检测到其表达,而在胰腺、脑和肺组织中的表达水平最高[7]。

2 WIG-1的结构与定位

WIG-1定位于细胞核,编码包含3个Cys2his2型锌指的锌指蛋白,WIG-1的锌指是由56～75个氨基酸连接而成的,定位于人类3号染色体长臂的26.3区(3q26.3),见图 1[8]。

图1 WIG-1定位图

WIG-1在转录水平的选择性拼接可以产生两种转录变异体(转录变异体1及转录变异体2),两种变异体序列中仅仅有一个氨基酸不同。相对于转录变异体1,转录变异体2在5′端的非编码区缺少一个片段,在编码区存在一个替代剪接位点,其开放读码框没有GCA密码子,编码序列含有288个氨基酸。WIG-1在生物进化过程中高度保守,其锌指蛋白氨基酸序列及结构在人类与鱼类中几乎完全一致[9]。这些锌指区域类似于早先发现的双链RNA结合蛋白,dsRBP-ZFa和JAZ。小鼠WIG-1与JAZ和dsRBP-ZFa一样是一个核蛋白,与其具有结构相似性。这种Cys2his2型锌指蛋白代表了一大类具有识别特殊DNA序列的蛋白,然而,这种蛋白也与单链RNA、DNARNA杂合体,dsDNA(双链DNA)和其他蛋白相互作用。同JAZ一样,WIG-1也定位于核内,这与小鼠WIG-1蛋白和已观察到的人与大鼠WIG-1蛋白在核内与核仁内的定位是一致的。由于WIG-1与dsRNA(双链RNA)而不是 ssRNA(单链RNA)相作用,所以WIG-1代表了一类与以往发现所不同的p53诱导基因[10]。

3 WIG-1的功能

3.1 与dsRNA的结合活性 目前研究己经证实小鼠WIG-1通过其第1个锌指区域与dsRNA相结合。异常表达FLAG标记的鼠WIG-1蛋白定位于细胞核,在某些细胞中定位于核仁,而GFP标记的鼠WIG-1则主要定位于核仁,WIG-1优先与dsRNA结合,而不是ssRNA或者dsDNA,WIG-1的第1个锌指区域对于dsRNA结合功能至关重要,而锌指2和3则不是必需的。在哺乳动物细胞中表达的WIG-1蛋白显示出与

dsRNA的高度亲和性,而在所有p53诱导表达的基因中,类似WIG-1的dsRNA结合活性是首次发现。这表明 WIG-1与JAZ和dsRBP-ZFa等dsRNA结合蛋白具有结构相似性,也进一步提示dsRNA结合在p53依赖的生理反应中可能具有重要作用[11]。

WIG-1由野生型p53诱导上调表达,是p53介导的转录活化的一个直接靶点。已有研究证实其是一个由p53直接转录的基因,并且是一个善意的目的基因,WIG-1的3个锌指区域包含在其第2、第4外显子核苷酸序列中,其与p53结合的同一序列相关。其中的2个锌指区域BM2和BM3,与重组p53共同形成DNA蛋白杂合体[12]。

WIG-1的第1个锌指区域对于在体外或活体细胞中结合dsRNA至关重要。野生型 WIG-1和ZF1、ZF2点突变型WIG-1都具有抑制细胞克隆形成能力的作用,证明这两个ZF突变对WIG-1抑制细胞增殖功能未造成重要的影响,但进一步的研究发现突变型WIG-1的复制效率要低于野生型WIG-1[11]。

有研究发现,人类WIG-1也结合dsRNA,WIG-1与活细胞中内生dsRNA的互相作用表明这种相互作用是与生理性相关的,但是它的确切机制和作用目前仍不清楚。WIG-1通过其N末端的锌指区域与50～100 bp长的dsRNA结合,WIG-1结合的21 bp的dsRNA与siRNA具有结构相似性。这些结构相似性,包括它们独特的锌指分布规律,表明它们的功能是相近的[5]。

3.2 抑制细胞增殖 WIG-1分子中锌指区域的发现,提示其可能是一种核苷酸结合蛋白,但目前对其在p53依赖的生理反应中所起的作用和机制仍知之甚少。小鼠与大鼠PAG608和人的WIG-1蛋白具有高度同源性,分别有97.9%和87%的氨基酸序列相同[13]。当大鼠PAG608在人类肿瘤细胞中过表达时,有较弱的促进凋亡活性。这也提示WIG-1可能具有启动细胞凋亡的功能。Issei等[14]进行的克隆实验结果表明,人WIG-1能够显著抑制食管鳞癌细胞增殖,其抑制率可达25%～30%。

有研究者认为WIG-1可能与miRNA(microRNA)调节的细胞生长和生存有关,并且具有启动p53诱导的细胞生长停滞和(或)诱导凋亡的作用,WIG-1与特殊的miRNA相结合能够增加由miRNA和它的mRNA形成的有缺陷的小二重区域的稳定性[11]。

在WIG-1启动子中,几个p53结合序列的存在反映了由p53和其家族成员p63、p73介导的是一个相当复杂的转录调节过程。p63、p73和 p53一样,能够结合相同的序列并上调目前已知的几种p53目的基因。p53以SP1或SP1相关蛋白作为一个共同因子,目的是达到p21和Bax启动子的最大活化。在WIG-1启动子中富含GC的区域也可以提供SP1结合位点[12],这与p53作用是非常类似的,但WIG-1是否能与p63及p73相结合进而发挥其功能尚有待进一步研究。

WIG-1的mRNA在脑与睾丸组织中表达水平相似,而在肺、肾、脾脏经过全身γ射线照射后表达上调,其中原因有可能是γ射线照射能够激活上述组织中p53的表达。WIG-1启动子有两个功能性的p53结合位点,使WIG-1可能具有p53依赖性转录调控功能,这也证明了WIG-1是一种善意的p53目的基因[12]。WIG-1与核糖体RNA相结合能干扰核糖体的合成,从而导致蛋白复制的抑制以及生长抑制,并最终导致细胞死亡,因此可能起到抑制肿瘤细胞增殖的作用[12]。

4 Cys2his2型锌指蛋白的功能

锌指蛋白是指含有通过结合Zn2+稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质,由于其自身的结构特点,可以选择性地结合特异的靶结构,使锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。

根据锌指结构序列和功能的不同将其分为9大类,TFⅢA锌指(Cys2his2),类固醇-甲状腺素受体(Cys8),GAL4锌指(Cys6),环状锌指(Cys3HisCys4),逆转录病毒粒子(Cys2hisCys),LIM锌指(Cys2hisCys5),GATA-1锌指(Cys4),Nup475锌指(Cys3His),requium 锌指(Cys4HisCys3)。根据锌指蛋白保守结构域的差异,又可以将其分为C2h2型(Krüppel相关型)、C4型和C6型等 3个类群。根据锌指的空间结构来综合分类,认为每一种锌指都可以在8组不同的折叠群中找到相应的归类,其分类为:类C2h2锌指、高音谱号锌指、钢卷尺状锌指、箝口膨出状锌指、类Zn2PCys6锌指、类 TAZ2锌指、锌结合短环锌指、金属硫蛋白锌指[15]。

Cys2his2型锌指蛋白的功能主要为两个方面:调控基因转录(即与核酸的相互作用)以及锌指蛋白之间的相互作用。Cys2his2型锌指蛋白能特异性地识别DNA,主要是由于其DNA结合域具有与DNA双螺旋互补的特殊表面结构,依靠其指型空间结构伸入到DNA双螺旋的大沟内,通过α螺旋与DNA碱基发生特异性接触[16]。另外,Cys2his2型锌指不仅能与DNA发生相互作用,也可以识别 RNA,如TFⅢA既可以与5SrDNA结合,也可以与该基因的转录产物5SrRNA结合形成7S RNP复合物[16]。Cys2his2型锌指蛋白还能与DNARNA杂交双链分子的特异性结合。转录激活因子 SP1与WIG-1一样同属Cys2his2型锌指蛋白,SP1主要通过调控富含GC启动子的基因表达,参与调节细胞功能,如细胞增生、凋亡、分化和肿瘤形成。近年来的研究表明锌指之间可以互相作用,锌指与锌指或锌指蛋白与锌指蛋白通过相互作用,能够识别更多不同的DNA或阻止锌指同DNA结合,进一步发挥调控基因转录的作用[17]。

5 小结与展望

以往研究证实,3q25～27区在包括肺鳞状细胞癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、卵巢癌以及前列腺癌等多种人类恶性肿瘤中均存在异常扩增[5],众多研究者相信在该区域极有可能筛选到可用于肿瘤基因诊断和治疗的候选分子。WIG-1基因由于具有对细胞生长周期和凋亡的调控作用,加之其定位在3q25～27区,使得研究者相信WIG-1有可能是潜在的候选肿瘤标志物和基因治疗靶点。由于研究时间尚短,WIG-1在恶性肿瘤发生发展中所起的作用及其分子机制还有待进一步研究。随着对WIG-1功能及其机制了解的不断深入,有望为p53介导的肿瘤抑制途径研究领域带来新的观点和突破。

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