甲状腺乳头状癌中DNA修复基因hMLH1的甲基化与BRAF突变的关系

宝 荣,邵 华,成建新,王 佾

(1.重庆市第九人民医院病理科 400700;2.中国医科大学附属盛京医院普外三科,沈阳110004;3.山东省滨州市人民医院病理科 256610)

上皮细胞起源的甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,也是近年来发病率增加最快的恶性肿瘤之一[1]。组织学上,最常见的甲状腺癌是乳头状甲状腺癌(PTC),约占甲状腺癌的80%。已有研究表明PTC中存在基因的甲基化现象,与PTC肿瘤腺外侵袭、淋巴结转移、多病灶等恶性病理特征关系密切,并且与 PTC中另一个重要的遗传事件——T1799A BRAF基因突变相关[2-4]。hMLH1是重要的DNA修复基因,在维持基因组稳定上发挥着重要作用[5]。本研究拟探讨PTC中是否存在hMLH1基因的甲基化,以及甲基化是否与临床病理特征相关、是否与BRAF基因突变相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究病例来自2005～2006年在滨州人民医院行甲状腺全切术的PTC患者(60例),其中男12例,女48例,年龄26～66岁,平均年龄44岁。获取肿瘤石蜡切片和临床病理学资料,包括肿瘤的甲状腺外侵袭情况、淋巴结转移和肿瘤分期。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)现行标准。另收集20例癌对侧甲状腺正常组织石蜡切片。

1.2 提取DNA 从石蜡组织切片中提取DNA。首先在室温下用二甲苯处理切片8 h以去除石蜡,然后在48℃下用1%十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5 mg/mL蛋白酶K消化48 h,其间为加快消化过程分2～3次加入 20%SDS-蛋白酶 K 3～5 μ L。随后用标准酚-氯仿提取术和乙醇沉淀法将DNA从消化后的组织中进行分离。

1.3 DNA的重亚硫酸盐处理 对DNA进行亚硫酸氢钠处理使胞嘧啶转化成尿嘧啶。首先将2 μ g DNA 和5 μ g鲑鱼精子DNA与0.3 M氢氧化钠在50℃进行孵育,接着加入500 μ L含有3 M亚硫酸氢钠和10 mM对苯二酚的新鲜混合液,在70℃孵育2～3 h。使用亲和层析柱对DNA标本进行提纯(Wizard?DNA Clean-Up System,Promega,美国)。提纯后的标本经0.3 M氢氧化钠在室温下处理10 min,用乙醇析出。将重亚硫酸盐处理过的DNA干燥后再次混悬于30 μ L水溶液中以备进行基因甲基化分析。

表1 本研究中用到的MSP引物序列和PCR退火温度

表2 hMLH1基因甲基化与肿瘤临床病理特征及BRAF突变的关系〔n(%)〕

1.4 T1799A BRAF突变分析 BRAF基因第15外显子的T1799A突变是PTC中占绝大比例的BRAF突变。本研究中,应用聚合酶链反应(PCR)对标本DNA BRAF基因的第15外显子进行扩增,引物序列:5′-TCA TAA TGC TTG CTC TGA T AG GA-3′(正 向)和 5′-GGC CAA AAA TT T AAT CAG TGG A-3′(反向)。扩增后的产物经过Big Dye循环反应后进行直接测序(ABI PRISM 3730基因测序仪,加拿大)。

1.5 甲基化特异性PCR(MSP) MSP反应在20 μ L含有重亚硫酸盐处理的DNA的反应混合液中进行。反应混合液包括约50 ng重亚硫酸盐处理的DNA,16.6 mM硫酸铵,67 mM Tris(pH 8.8),2 mM MgCl2,每种三磷酸脱氧核苷酸200 μ M(dATP,dCTP,dGTP和dT TP),200 nM正向引物和反向引物以及0.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司,美国)。MSP引物序列和PCR退火温度(表 1)。MSP反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,应用溴化乙锭进行显色。以经体外甲基化酶处理的DNA样品作为MSP的阳性对照。

1.6 统计学方法 全部数据输入Excel数据库,应用SPSS 11.5软件进行统计学分析。计数资料采用频率和百分数表示,计量资料应用表示。计数资料的统计应用χ2检验,计量资料的统计应用t检验。P值采用双侧检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 标本中DNA修复基因hM LH1甲基化状况 60例PTC标本中,hMLH1基因甲基化的发生率为23%(14/60)(图1)。hM LH1基因的甲基化与某些临床病理特征有相关的趋势,但没有统计学意义(P＞0.05)(表2)。20例正常甲状腺组织中,未检出hMLH1基因甲基化。

2.2 标本中 T1799A BRAF突变状况 60例PTC标本中,T1799A BRAF突变率为65%(39/60)(封 3图2)。突变与临床病理特征亦未见显著关联(表2)。20例正常甲状腺组织中,未检出BRAF基因突变。

图1 MSP结果示意图

2.3 基因甲基化与 T1799A BRAF突变的关系 携带T1799A BRAF突变的PTC病例中,33%(13/39)发生了DNA修复基因hMLH1甲基化;而携带野生型BRAF基因的PTC病例仅为 5%(1/21),二者之间差异有统计学意义(P=0.022)。

3 讨 论

DNA甲基化是重要的基因表达调节机制,尤其在胚胎发育时更是如此。生理情况下,甲基化存在于失活的X染色体和印记基因;正常表达的基因如管家基因,则不发生甲基化。肿瘤发生时,肿瘤细胞基因组局部区域基因存在高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因和血管形成抑制基因等,导致相应的基因沉默而致表达减少或完全丧失。与突变等基因学改变比较,DNA甲基化常常是肿瘤发生的一个重要的早期事件[6]。

本研究中探讨的基因——hM LH1是与DNA修复密切相关的基因,它位于染色体3p21.3区,参与了错配修复过程[5]。hM LH1基因甲基化或突变是结肠癌的常见遗传事件[7-9]。在甲状腺癌中,hM LH1基因的甲基化状况研究甚少。本研究结果表明,hM LH1基因的甲基化在PTC中并不常见。研究中发现的甲基化病例,其肿瘤有发生淋巴结转移及肿瘤分期较晚的趋势,尽管没有统计学差异,但仍提示甲基化可能参与了PTC的发生和发展。制研究历程中的突破性事件。这一突变导致BRAF蛋白第600位的氨基酸由 V变为E,造成 Ras→ Raf→MEK→ERK/MAP激酶通路(MAP激酶通路)的异常持续激活,促进PTC发生、进展和侵袭转移。BRAF基因突变发生于约45%的PTC和25%的甲状腺未分化癌(ATC)患者中,大样本的研究显示该突变与肿瘤的高恶性度相关[10]。本研究中BRAF突变虽然与肿瘤的腺外侵袭和淋巴结转移有相关的趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05),考虑是由于研究纳入的样本量较小。对BRAF基因突变导致甲状腺癌恶性程度增高的分子机制还没有令人信服的解释。最近的一些研究观察到甲状腺癌中BRAF基因T1799A突变与多种基因高甲基化的存在相关,如 SLC5A8、TIMP3、DAPK 和 RARβ2[11]。本研究也提示DNA修复基因的甲基化与BRAF基因突变有关。因为这些基因发生甲基化也预示肿瘤具有更多的恶性病理特征,推测BRAF基因突变可能是通过基因的甲基化改变导致肿瘤具有更高的侵袭性,更容易发生转移。

总之,本研究结果显示,PTC中DNA修复基因hMLH1甲基化较T1799A BRAF突变少见;甲基化的发生与肿瘤的临床病理特征差异无统计学意义(P＞0.05),但在携带T1799A BRAF突变的PTC病例中更为常见。

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