木贼中3种成分的HPLC-DAD-MS分析

许鑫 苏瑞 金敏婷 张舒婷 陈荣 方洪壮

（1佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2山东鲁抗医药股份有限公司，山东 济宁 272000）

木贼为木贼科木贼(Equisetum hiemale L.)的干燥地上部分，现收载于《中国药典》2010年版（一部）。木贼具有“疏散风热、明目、退翳”等传统功效和多种药理活性，主要含有酚酸类和黄酮类多种化学成分[1-3]。现今，木贼的质量控制方法，仅涉及其所含的黄酮苷或单一的黄酮苷元的含量测定[4-7]，而木贼中的酚酸类成分的含量测定尚未见报道。为了更全面地控制木贼药材的质量，本研究采用HPLC-DAD-MS/MS技术，通过木贼色谱峰的质谱数据并结合文献[8-10]，推断化合物的归属，进而与对照品的色谱、光谱、质谱比对，确定了酚酸成分阿魏酸及2种黄酮苷元，蜀葵苷元与山柰素；建立了木贼中阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素3种成分含量同时测定的HPLC多波长法。所建立木贼药材中3种成分含量同时测定的方法，准确可靠、灵敏度高，可供木贼质量控制与评价参考。

1 仪器和材料

Agilent 1200系列高效液相-质谱联用仪(美国安捷伦仪器有限公司)，包括G1311A四元泵，G1322真空脱气机，G1329自动进样器，G1315DAD检测器，6310离子阱质谱检测器。木贼药材6批，其中5批2008年购于国内不同城市，1批2008年秋采自于黑龙江伊春地区，经佳木斯大学药学院宗希明高级实验师鉴定为木贼科植物木贼（Equisetum hiemale L.）。阿魏酸、山柰素对照品（中国食品药品检定研究院）；蜀葵苷元对照品（上海永恒生物有限公司），纯度99.8%；乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸、醋酸铵、盐酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定条件

2.1.1 HPLC-DAD条件ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)－0.2%甲酸水(B)为流动相，梯度洗脱程序：0 ～ 10 min，18%(A)；10 ～ 20 min，18% ～38%(A)；20 ～ 27 min，38%(A)。柱温 35℃，进样量 20 μL，检测波长276、323 nm、366 nm。

2.1.2 HPLC-DAD-MS条件紫外检测波长为282 nm，光谱波长记录范围210～400 nm，波长间隔2 nm。蜀葵苷元和山柰素的定性的色谱条件同“2.1.1”项，阿魏酸的定性时的流动相为甲醇－0.1%醋酸铵，洗脱梯度，47 min内甲醇由5%线性升至100%。质谱条件为：Turbo Ion spray(ESI源)，干燥气的体积流量10 L/min，干燥气的温度350℃，雾化室压力35.0 psi，扫描范围m/z 50～1 000 amu；负离子模式检测，多级反应检测扫描方式，柱后1∶1分流。

2.2 溶液的制备

2.2.1供试品溶液参照2010版中国药典木贼的含量测定项下的提取方法[5]，取过三号筛的粉末约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，加盐酸10 mL，置水浴中加热水解1 h，放冷，转移至50 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.2对照品溶液精密称取阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素对照品适量，以甲醇溶解制备混和对照品储备液，阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素浓度分别为0.10、0.16、0.50 mg/mL。避光冷藏。测定时，按所需浓度将储备液用甲醇稀释成对照品混合溶液。

2.3 定性分析

2.3.1蜀葵苷元与山柰素的定性取供试品溶液，按“2.1”项下HPLC-DAD-MS条件测定。供试液在282 nm下的色谱图及供试液的质谱总离子流图见图1。图1中保留时间21.57 min化合物，准分子离子峰为m/z 301[M-H]－，二级质谱主要碎片离子为m/z 283[M-H-H2O]－、m/z 273[M-CO]－、m/z 245[M-CO-H2O]－、m/z 229[M-CO-H2O-O]，与文献中报道的蜀葵苷元相一致[8]，推断为蜀葵苷元。26.15 min的化合物，准分子离子峰m/z 285[M-H]－、质谱主要碎片离子为 m/z 267[M-H-H2O]－、m/z 257[M-H-CO]－、m/z 229[M-H-CO-CO]－、m/z210.9[M-H-HCOOH]、m/z184[M-H-C4H4O3]，与文献中的山柰素质谱数据相同[8]，推断为山柰素。取对照品混合溶液，按供试液测定条件进行测定，经样品中的初判化合物与相应对照品的保留时间、紫外光谱和质谱的比对，最终确定上述两个化合物分别为蜀葵苷元和山柰素。

图1 蜀葵苷元与山柰素定性时的木贼色谱图(A)与总离子流图(B)

2.3.2阿魏酸的定性按“2.2.1”项下的条件测定供试品溶液。供试液在282 nm下的色谱图与供试液的质谱总离子流图见图2。图2中保留时间9.94 min化合物，准分子离子峰为m/z 193[M-H]－，二级质谱主要碎片离子为m/z 177.9[M-H-OCH3]－、m/z 133.9[M-H-OCH3-COO]－，与文献中报道的阿魏酸一致[10]，初步将该化合物判为阿魏酸。另取对照品混合溶液，按上述条件测定，通过与对照品的保留时间、紫外光谱及质谱数据的比较，确定该化合物为阿魏酸。

2.4 定量分析

2.4.1色谱系统适用性根据HPLC-DAD的紫外光谱图，选定阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的最大吸收波长323、276、366 nm为测定波长，供试液在上述波长下的色谱图见图3。3种物质的理论板数分别为13 002、115 936、121 641，分离度分别大于3.6、3.5、3.4。另取适当浓度的对照品混合溶液，连续进样5次，及5 d分别进样，考察阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素色谱峰的相对保留时间及峰面积的重复性，各峰相对保留时间及峰面积的日内和日间RSD值见表1。由所测数据可知，色谱系统的各项指标均满足于定量要求。

图2 阿魏酸定性时的木贼色谱图(A)与总离子流图(B)

图3 供试品定量波长下的色谱图

表1 阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的相对保留时间与峰面积重复性

2.4.2线性关系精密量取混合对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分别置 100 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按设定的色谱条件测定峰面积。以阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素质量X对色谱峰面积Y计算回归方程。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素分别在 0.02 ～ 0.2 μg、0.032 ～ 0.32 μg、0.1～1 μg范围内与各自的峰面积的线性关系良好，结果见表2。

2.4.3检测限和定量限以甲醇逐级稀释混合对照品储备液，在选定色谱条件下测定。取信噪比S/N=3时的质量为最低检测限，S/N=10时的质量为最低定量限。阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素的最低检测限和最低定量限见表2。

2.4.4稳定性试验取供试品溶液，室温下放置，按上述色谱条件分别每间隔1 h进样测定，计算阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素峰面积的相对标准偏差。结果表明，化合物阿魏酸、蜀葵苷元的峰面积值在4 h后开始减少，3种物质在4 h内峰面积的RSD分别为 1.40%，0.30%，0.10%。供试品溶液室温条件下，4 h内稳定性良好。

2.4.5回收率试验分别取已知含量的同一产地样品6份，各约0.75 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，每份样品加入4.5 mL混合对照品储备液，水浴蒸干甲醇，精密称定。按“2.2.1”项下自“精密加入 75%甲醇 50 mL”起操作，制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，记录峰面积，计算加样回收率。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的平均回收率分别为100.1%、99.4%、99.7%，RSD分别为0.89%、1.5%、1.3%。

表2 木贼药材中3种成分的标准曲线、检测限与定量限

2.4.6样品的测定按供试品溶液制备方法及定量色谱条件，测定不同来源的6批木贼药材中的3种成分的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 以乙腈-0.2%甲酸水溶液为色谱流动相质谱定性时，未检测到阿魏酸。可能在此条件下，阿魏酸未能离子化，得不到其母离子及其相关的碎片离子。因此，将甲酸改换为醋酸铵以促进阿魏酸的离子化。又因以乙腈－醋酸铵水溶液为流动相时，阿魏酸与溶剂同时出峰，故采用甲醇－0.1%醋酸铵水溶液为流动相。

表3 6批木贼药材3种成分的百分含量

3.2 定量分析时，为增强测定的灵敏性和选择性，采用了多个波长同时测定的方法，测定波长分别选在阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素的紫外最大吸收处的波长。

3.3 所测定的3种活性成分均为供试品溶液色谱中信号较强的化学物质。木贼药材中，经HPLC-DAD-MS/MS定性分析虽有槲皮素等黄酮的存在，但色谱信号强度较阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素低的多，难以与这3种活性成分同时定量。

[1]李德坤，李静，李平亚，等.木贼科植物研究概况Ⅱ.药理活性[J].中草药，2000，31(8)：附 7-9.

[2]Eun YP，Hoon J.Antioxidant and anti-inflammatory activities of equisetum hyemale[J].Nat Prod Sci，2008，14(4)：239-243.

[3]张承忠，赵磊，李冲，等.木贼化学成分研究 [J].中草药，2000，33(11)：978-979.

[4]赵磊，李冲，张承忠，等.木贼中三种黄酮苷的含量测定[J].中国现代应用药学杂志，2005，22(2)：159-161.

[5]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：58.

[6]张宪，赵惠萍，张小茜，等.木贼质量标准的研究[J].中国中医药信息杂志，2005，12(5)：48-49.

[7]高汉成，何明三，韩宁涛.木贼乙醇提取物中槲皮素HPLC法含量测定的研究[J].湖北中医学院学报，1999，1(3)：29-31.

[8]Petsalo A，Jalonen J，Tolonen A.Identification of flavonoids of Rhodiola rosea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2006，1112，(1-2)：224-231.

[9]Tsimogiannis D，Samiotaki M，Panayotou G，et al.Characterization offlavonoid subgroups and hydroxy substitution by HPLC-MS/MS[J].Molecules，2007，12(3)：593-606.

[10]许高燕，刘莹雯，银董红.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸、阿魏酸和咖啡酸的含量[J].分析科学学报，2006，22(5)：567-569.