液相色谱法测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度

金 立，沈林辉，曹向英，孙文梅，朱 骏

（上海市松江区食用农产品安全监督检测中心，上海 松江 201611）

三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，相对分子质量为126.12，其进入体内后几乎不能被代谢，而是从尿液中原样排出。但是，由于体质不同，它会在身体内与氰脲酸结合生成晶体状聚合物，从而引起肾结石、膀胱结石等症状。本文通过数学建模，对GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法——高效液相色谱法》测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度来源进行分析，并对测量的不确定度进行评定。

1 实验过程

1.1 仪器与设备 Waters2695高效液相色谱仪（2487紫外检测器）；Eppendorf 5810离心机；AE240分析天平（感量为 0.000 01g），Mettler Toledd公司生产；科导超声波清洗机；Waters SCX阳离子交换固相萃取柱（60mg/3mL）。

1.2 材料与试剂 样品为随机抽检的牛奶三聚氰胺高纯度试剂（纯度>99%），FLUKA；己烷磺酸钠、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 样品处理 称取2g（±0.01g）试样，置50mL具塞离心管中，加1%三氯乙酸溶液15mL和5mL乙腈，超声提取10min，4 000 r/min离心10min。上清液用三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，再用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后作待净化液。

固相萃取柱依次用3mL甲醇和5mL水活化。取所有待净化液过柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，挤干，用6mL氨化甲醇洗脱。洗脱液于50℃下用氮气吹干，用流动相1.0mL定容，涡旋混合1min，经0.45μm微孔滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法测定。

1.4 数学模型

式中：X——供试试样中三聚氰胺的残留量（mg/kg）；

A——试样溶液中相应三聚氰胺的峰面积；

As——对照溶液中相应三聚氰胺的峰面积；

Cs——对照溶液中相应三聚氰胺的浓度（μg/kg）；

V——样液最终定容体积（mL）；

m——供试试样的质量（g）。

2 测量不确定度的来源

2.1 标准溶液浓度的不确定度u（Cs）

2.2 试样的称样量不确定度u（m）

2.3 标准工作曲线的不确定度u（std）

2.4 试样峰面积测定的不确定度u（A）

2.5 定容体积的不确定度u（V）

2.6 试样中添加回收率的不确定度u（R）

3 测量不确定度的计算

3.1 标准溶液浓度的不确定度u（Cs）

3.1.1 根据标准物质证书提供的信息，三聚氰胺的纯度≥99.0%，不确定度半宽a=1%，服从均匀分布不确定度为：

3.1.3 配制标准储备液的不确定度

（2）充满液体至容量瓶刻度的变动性，通过重复测定进行统计，重复10次统计出标准偏差为0.12mL，从而引起的相对不确定度：

（3）实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃器具膨胀系数为2.5×10-5/℃，水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，甲醇体积膨胀系数为 1.2×10-3/℃。实验过程中使用的甲醇溶液(1∶1,V/V)的平均体积膨胀系数为7.0×10-4/℃。容量瓶校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值：

按照均匀分布换算成标准偏差为：

3.1.4 标准工作液配制过程产生的不确定度 评定标准工作液是由三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的，质量浓度分别为 0.8、2、20、40 μg/mL。标准工作液制备过程使用了一系列玻璃量具，根据JJG 196-2006要求，均有相应最大允差，按均匀分布，相对不确定度分量见表1。

求出此分量的合成标准不确定度：

表1 标准液配制过程中量具校准引起的不确定度

3.2 试样的称样量u（m）

（1）天平称量变动性：标准偏差0.02mg。

相对不确定度：ur（elm）=u（m）/m＝0.035（/2.0×1000）＝0.0000175

3.3 标准工作曲线拟合的不确定度u（std） 用最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-峰面积曲线。分别测定4 种质量浓度的三聚氰胺标准液 0.8、2、20、40μg/mL，每种质量浓度分别测3次，得到相应的峰面积A，测定结果见表2。

表2 最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-峰面积结果

用表2数据以最小二乘法拟合的标准曲线为：Y=87276X-9127，R2=0.9998。

峰面积测量的标准偏差S为：

校准曲线拟合的标准不确定度u（std）为：

标准工作曲线拟合的相对不确定度：

对被测样品处理溶液测量两次，即p=2；n表示标准溶液测定次数，n=12；a表示截距，a=-9 127；b为斜率，b=87 276；C0为处理液中三聚氰胺最佳估计值（2.00mg/kg）；Ci表示标准溶液各点的三聚氰胺含量；表示标准溶液中三聚氰胺含量的平均测定值（15.7mg/L）。

3.4 样品峰面积测定的不确定度u（A） 由于测量次数较少，根据JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》中，采用极差法进行评定，其中n=6，C=3.0。标准不确定度：uA=（222706-217451）/3=1751。

表3 重复进样测量结果

3.5 定容体积的相对标准不确定度urel（V）

3.5.1 定容采用1mL单刻度吸量管A级，按检定规程JJG 196-2006要求,最大允差为0.007mL，按照均匀分布考虑，则定容体积的相对标准不确定度：

3.5.2 1mL单标线吸量管校准温度与使用温度不同引起的体积不确定度：

按照均匀分布换算成标准偏差：

由以上两项合成得出：

3.6 试样中添加回收率的不确定度u（R） 因样品前处理不完全或处理过程中三聚氰胺的损失，通过添加三聚氰胺（质量浓度7.5mg/kg）计算加标回收率：

表4 回收率测定结果（添加浓度为7.5mg/kg，n=6）

3.7 合成标准不确定度的计算

3.8 扩展不确定度 扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平为95%，则k=2，试样中三聚氰胺含量测定的相对扩展不确定度u=urel（X）×k=0.080。试样中三聚氰胺含量的最佳估计值（X）=2.00mg/kg，故其扩展不确定度 u=2.00mg/kg×0.080=0.160mg/kg。

4 不确度报告

用高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺含量，当取样量为2.00g，k=2（95%置信度）时，测得牛奶中三聚氰胺的含量为（2.00±0.160）mg/kg。

[1]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[2]田玉平，王 虎，蒋和平.高效液相色谱法测定乳及乳制品中三聚氰胺含量的不确定评定[J].实验室研究与探索，2010，29（1）：41-43.

[3]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1135-2005化学分析测量不确定度评定[S].北京：中国计量出版社，2005：1-12.

[4]国家质量监督检验检疫总局.JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006：6-9.

[5]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1059-1999测量不确定度评定与表示[S].北京：中国计量出版社，1999：1-31.