生长抑素受体1在皮质发育障碍大鼠海马的异常表达

张建刚 宋延波 张 毅 贺 兴 冯 飞 晏 勇

重庆医科大学第一附属医院 1)神经内科 2)肿瘤科 重庆 400016

皮质发育障碍(DCDs)是一种大脑皮质发育异常,包括大脑皮质的神经元正常而结构异常的脑畸形。目前DCDs发生率仍然不清楚,但随着磁共振影像(MRI)的应用,DCDs的诊断率明显增加。估计25%～40%的难治性或耐药性小儿癫由DCDs引起[1],且至少75%的DCDs病人患有癫[2]。DCDs的发生是由正常的皮质神经元的异位或异常的皮质神经元出现所造成,而这些异常的神经元导致皮质的异常网络形成。影响胚胎期神经元移行的因素很多,如基因突变、射线、冰冻、化学药物等。因此国内外学者利用射线照射、液氮冷冻以及化学药物甲基氧化偶氮甲醇注射的方法建立神经元移行异常的动物模型。一定剂量的射线会造成移行神经元的死亡,Hicks等[3]发现幼稚的、正处于迁移状态的神经元对射线的损伤敏感度较高。本课题组选择X射线照射的方法建立神经元移行异常的模型,并在前期的工作中通过对皮质发育障碍大鼠模型大脑组织进行基因芯片的筛查发现了一些导致神经元迁移紊乱的基因。本实验对其中的生长抑素受体1进一步研究探讨皮质发育障碍神经元迁移紊乱的机制及其致癫机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 6只SD孕鼠用于实验(由第三军医大学大坪医院动物中心提供),体质量300～350 g。幼鼠出生当天计为P0,饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境,自由进食。6只孕鼠实验按需要完全随机分成2组,皮质发育障碍组3只孕鼠和3只正常对照组孕鼠各出生30幼鼠,P60时在保持性别比例对等的前提下完全随机各选取5只进行免疫组化检测,5只进行Western Blot检测。

1.2 X射线照射诱导的皮质发育障碍模型的建立 将3只孕15 d SD大鼠分别放入长20 cm、宽10 cm、高 10 cm的纸盒中,置于直线加速器治疗机进行X射线照射,照射剂量200CGY,剂量率200CGY/min,时间60 s[4]。照射后的孕鼠正常喂养待其分娩。幼鼠在其出生后21 d断奶。常规饲养至60 d。

1.3 免疫组化检测 sstr-1免疫组化采用SABC法。检测方法：二甲苯浸泡脱蜡,梯度酒精脱水,枸橼酸缓冲液抗原修复20 min,3%H2O2灭活内源性酶15 min,正常山羊血清封闭抗原30 min,去除血清,加入兔抗sstr-1多克隆抗体(Santa Cruz公司,浓度为1∶200),37℃孵育2 h。根据SABC试剂盒完成ABC步骤。以上每一步骤之后均用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,p H=7.2～7.6)洗涤3次,每次5 min。DAB显色后用去离子水洗涤,然后经苏木素复染,二甲苯透明,最后中性树胶封片。

1.4 Western Blot检测 快速断头取大鼠海马,按常规进行组织蛋白质提取,运用BCA法测定蛋白质的浓度,取约50 μL蛋白质用于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至PVDF膜后,用TBST缓冲液室温封闭1 h,加入兔抗sstr-1蛋白抗体(1∶200)或兔抗β-actin抗体(1∶2000)(Santa Cruz公司),在4℃下孵育过夜,用 TBST溶液洗膜4次,每次8 min。室温下相应加入羊抗兔IgG(北京中杉1∶2000)抗体孵育2 h,然后采用同法洗膜4次,应用增强型化学发光试剂(Santa Cruz公司)显色,最后凝胶成像分析系统摄像。

1.5 统计学分析 用SPSS 15.0软件包对数据进行统计学分析。描述性数据以均数±标准差(±s)表示,两独立样本均数间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化 皮质发育障碍组大鼠海马区sstr-1阳性细胞的数量明显减少,染色强度也明显减弱。特别是在海马的CA 1区减少更为明显。皮质发育障碍组大鼠海马区sstr-1的表达主要集中在神经元细胞的胞浆。在正常情况下,正常组大鼠海马区神经元细胞的胞浆中有一定强度的sstr-1表达。见图1。

图1 sstr-1免疫组化染色 a 正常对照组大鼠海马中高表达(4×10);b 皮质发育障碍组大鼠海马中低表达(4×10);c 正常对照组大鼠海马免疫反应阳性细胞,阳性表达部位主要在细胞核(40×10);d 皮质发育障碍组大鼠海马免疫反应阳性细胞,阳性表达部位主要在细胞核(40×10);箭头：阳性细胞

图2 皮质发育障碍组和正常对照组大鼠海马sstr-1 Western Blot结果分析 A 对照组泳道为 1、3、4、7、8;皮质发育障碍组泳道为 2、5、6、9、10;sstr-1 条带在 65 k D,β-actin条带在42 k D;β-actin作为阳性参照 B DCDs组 sstr-1平均OD值显著低于对照组(*P＜0.05)

2.2 Western Blot 免疫印迹检测结果显示膜上约65 kD的位置上可见黑色阳性杂交带,即为sstr-1蛋白表达,从杂交信号的强度看,皮质发育障碍大鼠海马组织标本中的sstr-1蛋白表达明显弱于对照组;β-actin的阳性杂交条带出现在42 kD的位置。使用Quantity one采图分析软件得出每个条带的平均OD值(每个目的条带与相应的β-actin OD值的比值),DCDs组的平均OD值为0.59±0.15,对照组的平均OD值为 1.02±0.14(P＜0.05)。见图2。

3 讨论

sst家族分为5个亚型,sstr-1即生长抑素受体1,它的基因定位于6q23。在海马区主要分布在CA 1区、齿状回、内嗅皮质。功能较为复杂：(1)sstr-1与神经肽Y一起作用对细胞的活动起启动作用[5-6]。原位杂交法发现sstr-1和神经肽Y在大鼠下丘脑内侧基底部的细胞中共表达。也有关于sstr-1与生长激素释放激素在漏斗核细胞共表达的报道[7]。其他组织关于sstr-1的研究也很多。Watt等[8]发现在乳腺癌细胞有sstr-1和sstr-5表达,而且表达量与肿瘤体积成正比,与瘤细胞分化程度成反比。提示sstr-1可能对于低分化细胞的增值、分化等有一定作用。生长发育的神经元中的sstr-1可能有相似的作用。(2)有人采用基因敲除技术观察sstr-1(-/-)小鼠模型胰岛素分泌以及内环境稳定情况意外发现sstr-1(-/-)模型鼠除了表现内环境的紊乱外,还明显表现出来躯体生长发育迟滞[9]。

我们前期的基因芯片扫描发现sstr-1基因表达下调,本实验的前期结果显示皮质发育障碍组大脑外形与正常组相比明显变小,体积缩小。HE染色显示皮质发育障碍大鼠海马区特别是CA1出现明显的神经元迁移紊乱。说明X射线诱导的皮质发育障碍大鼠模型是能够很好地模拟人的皮质发育障碍。在免疫组化中皮质发育障碍大鼠模型海马区sstr-1的表达减少,特别是在海马的CA1区显著减少,Western Blot蛋白定量进一步显示在皮质发育障碍大鼠模型的海马区sstr-1表达下调。本实验模型表现的大脑发育障碍及癫易感性的特点,sstr-1下调很可能起了重要作用。

[1]Kuzniecky RI,Jackson GD.Magnetic resonance in epilepsy[J].New York ：Raven Press,1995 ：183-202.

[2]Leventer RJ,Phelan EM,Coleman LT,et al.Clinical and imaging features of cortical malformations in childhood[J].Neurology,1999,53：715-722.

[3]Galileo D,Majors J,Horwitz A,et al.Retrovirally introduced antisense integrin RNA inhibits neuroblast migration in vivo[J].Neuron,1992,9：1 117-1 131.

[4]Nakanishi K,Watanabe K,Kawabata M,et al.Altered synaptic activities in cultures of neocortical neurons from p renatally X-irradiated rats[J].Neurosci Lett,2004,355(1/2)：61-64.

[5]Okazaki Y,Furuno M,Kasukawa T,et al.Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs[J].Nature,2002,420(6915)：563-573.

[6]Fodor M,van Elk EJ,Huizinga CT,et al.NPY neurons exp ress somatostatin receptor subtype 1 in the arcuate nucleus[J].Neuroreport,2005,16(1)：29-32.

[7]Tannenbaum GS,Zhang WH,Lapointe M,et al.Growth hormone-releasing hormone neurons in thearcuate nucleus exp ress both sst1 and sst2 somatostatin recep tor genes[J].Endocrinology,1998,139：1 450-1 453.

[8]Watt HL,Kumar U.Colocalization of somatostatin recep tors and epidermal growth factor receptors in breast cancer cells[J].Cancer Cell Int,2006,6(1)：5.

[9]Wang XP,Norman M,Yang J,et al.Alterations in glucose homeostasis in sstr-1 gene-ablated mice[J].Mol Cell Endocrinol,2006,247(1/2)：82-90.

[10]Cammalleri M,Martini D,Timperio AM,et al.Functional effectsof somatostatin receptor 1 activation on synaptic transmission in the mouse hippocampus[J].J Neurochem,2009,111(6)：1 466-1 477.

[11]Cammalleri M,Cervia D,Langenegger D,et al.Somatostatin receptorsdifferentially affect spontaneous epileptiform activity in mouse hippocampal slices[J]. Eur J Neurosci,2004,20(10)：2 711-2 721.