伤寒沙门菌动物模型研究进展

杨燕茹，吴淑燕，黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 215123

自1881年人类首次从伤寒患者体内分离出伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S.typhi)，迄今为止已有100余年历史。人类伤寒在发展中国家仍然是一种严重的传染病，每年全球大约有2 100万人感染，其中死亡人数超过21万，即使在发达国家也时有暴发流行[1,2]。近年来，由于抗生素的滥用，伤寒沙门菌多重耐药突变株频现，导致治疗更加棘手。由于伤寒沙门菌具有严格的宿主特异性，又缺乏理想的动物模型，因此制约了对该菌致病机制及其疾病防治的研究。伤寒沙门菌宿主特异性的机制目前尚不明确，可能与不同宿主网状内皮系统的固有差异有关[3]，也有学者认为基因组下调及新基因的获得介导了伤寒沙门菌的宿主特异性[4]。目前普遍认为，自然条件下伤寒沙门菌只感染人类和高等灵长类动物。早先人们曾在伤寒患者或志愿者体内观察并研究伤寒的发病机制。直至1960年，Edesall等用黑猩猩建立了伤寒感染模型，并观察到与伤寒患者相似的症状[5]，但由于这些灵长类动物模型稀有且价格昂贵，其应用受到限制。人们迫切希望建立伤寒沙门菌合适的动物模型，用以模拟细菌在人体内的致病过程，为研究人类伤寒的发病过程，伤寒沙门菌的致病机制、变异规律及抗菌药物的研发提供手段和工具。本文就伤寒沙门菌动物模型的最新研究进展作一综述。

1 免疫系统人源化小鼠模型

最新研究发现，将人造血干细胞移植到免疫缺陷实验小鼠体内后，建立人源化小鼠模型，移植细胞在小鼠体内可发育成人类的各种免疫细胞，并能在抗原刺激下产生功能性免疫应答。

2010年，Mian等利用严重免疫缺陷小鼠Rag2-/-γc-/-构建了人源化小鼠[6]。Rag2-/-γc-/-小鼠源于一种V17的胚胎干细胞系，由BALB/c与129小鼠杂交获得，靶向敲除Rag2、IL2rg基因。新生的Rag2-/-γc-/-小鼠用亚致死剂量60Co照射破坏免疫系统后，肝内注入自人脐带血中分离的CD34+造血干细胞与祖细胞，其后在肝、脾、骨髓、胸腺及淋巴结均检测到人类免疫细胞。建立人源化Rag2-/-γc-/-小鼠模型后，将伤寒沙门菌经静脉注入小鼠体内，发现在第6～7天小鼠生存率明显下降，伴有体重减轻、摇摆、旋转和共济失调等神经系统症状，类似伤寒患者因细菌入侵中枢神经系统后并发脑膜炎的临床表现。此外，第2～9天在感染小鼠肝、脾、骨髓和血液等部位均检测到大量细菌，表明伤寒沙门菌能在免疫系统人源化(humanized immune system, HIS)小鼠模型中增殖并造成持续性感染。

Song等也用这种免疫系统缺陷小鼠做了类似研究[7]。与Mian等不同的是，所移植的人CD34+造血干细胞来自胎儿肝脏。将伤寒沙门菌经腹腔感染小鼠后发现，在鼠源CD45+细胞中没有伤寒沙门菌，而人源CD45+细胞内却有大量细菌，且感染4周后人源CD45+细胞数量明显减少，表明人源CD45+细胞是伤寒沙门菌作用的靶细胞。此外，感染4周的小鼠体内人源细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)、IL-10、IL-12、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)及人类抗伤寒沙门菌的抗体均明显增加。为进一步探究鼠源免疫系统对伤寒沙门菌有无作用，Song等将实验小鼠的nramp1(natural resistance-associated macrophage protein 1)基因敲除，获得人源化Rag2-/-γc-/-nramp1-/-小鼠。研究发现，与人源化Rag2-/-γc-/-nramp1+/+小鼠相比，伤寒沙门菌对两种小鼠的致病性无明显差异，表明nramp1基因在人源化小鼠体内未参与抗伤寒沙门菌感染过程。该研究者还在实验小鼠体内评估了多个伤寒沙门菌减毒株(ΔpltB、ΔphoP/Q诱变株)的感染情况及效价，并将感染时间延长至4周，更加符合人类伤寒的自然发病时程，展示了HIS小鼠模型除用于研究伤寒沙门菌感染机制外，在评估疫苗效果等方面的应用前景广阔。

Libby 等利用另一免疫功能缺陷小鼠NOD-scidIL2Rγnull进行了类似研究[8]。NOD-scidIL2Rγnull小鼠是缺乏IL-2受体普通γ链的非肥胖性糖尿病小鼠，IL-2γ链是IL-2与其高亲和性配体结合及细胞内信号转导所必需的[9]，缺乏会导致T细胞、B细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞的成熟障碍[10,11]，造成小鼠天然免疫及适应性免疫功能缺陷。Libby等将出生1～2 d的小鼠经60Co照射后，心脏内注入来自人肝脏的CD34+造血干细胞悬液，10周后在小鼠体内检测到人源CD45+和人源CD3+T细胞。Libby等将伤寒沙门菌经腹腔感染小鼠2～3 d后，脾脏即出现肉芽肿样炎症、多核巨细胞和病变的淋巴细胞等现象；在肝内出现库普弗细胞(枯否细胞)肿胀和中央小叶肝细胞病变等特征；血液中人源细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α和人源单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)均升高，与严重伤寒患儿IL-6、TNF-α升高和炎症细胞死亡现象相似。人源化NOD-scidIL2Rγnull小鼠对研究伤寒沙门菌致病过程的作用毋庸置疑，但缺陷是感染细菌2～3 d后小鼠很快死亡，短暂的感染期决定了此模型只能用于研究发生伤寒急性败血症时宿主与病原菌的相互作用，而不能用于亚急性和持续性细菌感染等方面。

上述HIS小鼠感染伤寒沙门菌后观察到不同的实验结果，可能与以下因素有关：实验小鼠种系选择存在差异；移植的CD34+造血干细胞的来源、输注水平及移植途径有差异；用于感染的实验菌株、途径和剂量等不同。HIS小鼠模型的广泛推广还存在瓶颈，如移植需要专业人员的熟练技巧、操作过程繁琐及移植细胞来源紧缺且价格昂贵，动物的异质性及人类干细胞获取和输注等对实验结果的直接影响。事实上，HIS小鼠的免疫系统是小鼠和人类造血干细胞共存的嵌合体，在伤寒沙门菌感染时可能存在相互作用的假象，干扰实验结果的分析[12]。另外，伤寒沙门菌通常是经粪-口感染，而实验感染途径却为腹腔或静脉，并非正常感染途径。已有文献报道，伤寒沙门菌经口感染HIS小鼠后会被立即清除，不能在肠道网状内皮系统造成病变[13]，且人类干细胞可能与小鼠胃肠道免疫系统协同维持伤寒沙门菌的感染，因此该模型目前尚不能通过自然感染途径来模拟伤寒沙门菌与肠道上皮细胞的相互作用。

2 诱导型一氧化氮合酶基因敲除小鼠模型

当病原菌入侵机体时，巨噬细胞和中性粒细胞等受刺激，细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)激活，产生大量一氧化氮(nitric oxide,NO)，发挥抗菌作用，从而实现宿主防御。已证实，NO在小鼠对抗鼠伤寒沙门菌感染中具有重要作用。由于鼠伤寒沙门菌与伤寒沙门菌存在诸多差异，为探讨NO在小鼠对抗伤寒沙门菌感染中的作用，Alam等[14]运用iNOS基因缺陷小鼠开展了相应研究。实验中iNOS缺陷纯合子小鼠(iNOS-/-)由2个杂合子小鼠(iNOS+/-)交配获得，同窝iNOS-/-和iNOS+/+小鼠用于实验。用伤寒沙门菌株经腹腔感染iNOS-/-和iNOS+/+小鼠后，后者半数致死量(median lethal dose，LD50)高于前者6倍多，说明iNOS基因敲除小鼠对伤寒沙门菌更易感。伤寒沙门菌感染iNOS-/-小鼠后，可检测到肝组织病变及腹膜巨噬细胞凋亡，表明iNOS的表达与小鼠对伤寒沙门菌的天然抵抗有关。NO是小鼠抵御伤寒沙门菌感染中的重要因素，主要通过阻止伤寒沙门菌诱导宿主细胞凋亡和直接杀菌来介导宿主的防御机制。已知伤寒沙门菌RpoS作为Sigma因子，调控了诸多基因特别是毒力基因spv的表达。Alam等发现，与野生株相比，伤寒沙门菌rpoS突变株可明显增高感染野生型小鼠的LD50，而iNOS基因缺陷型小鼠LD50无明显变化，说明RpoS在伤寒沙门菌抵御宿主NO依赖性的防御机制中扮演重要角色。伤寒沙门菌的致病性取决于病原菌与宿主应答两方面，与NO对细菌和宿主的各种生物功能调节有关。但由于NO依赖性的防御机制只是宿主对抗病原菌入侵时的复杂防御机制之一，iNOS基因敲除小鼠模型在研究伤寒沙门菌致病机制中的作用尚待进一步研究。

3 展望

本课题组长期致力于伤寒沙门菌致病的分子机制研究，应用体外细胞模型证实我国独特的基因资源——伤寒沙门菌嵌合型质粒pRST98可通过诱导宿主细胞凋亡等途径来增强细菌毒力[15]。Groisman等发现，伤寒沙门菌双信号调节系统(PhoP/PhoQ)调控多种毒力基因的表达，且该系统存在正反馈调节通路[16]。然而，感染的发生和发展过程极其复杂，受体内多种因素的调节，动物模型的建立使感染的发生更接近于自然状态，有助于深入剖析病原菌与宿主相互作用的分子机制和调控网络。由于伤寒沙门菌的严格宿主特异性，其动物感染模型建立非常困难。尽管上述HIS和iNOS基因敲除小鼠目前均存在不尽如人意之处，仍不失为研究伤寒沙门菌致病机制及其疾病防治策略的有力工具。

最近有学者提出，细菌基因退化赋予伤寒沙门菌严格的宿主特异性，由此拟将伤寒沙门菌与其他多宿主沙门菌进行基因比较，然后通过分子生物学手段，将可能决定宿主易感性的基因导入伤寒沙门菌中，使其能感染更多的宿主，有望建立新的伤寒沙门菌动物模型。近年来，活体成像技术在感染动物模型中的应用越来越受到关注，此技术最早应用于动态观察转化了荧光素酶的鼠伤寒沙门菌在小鼠体内的增殖分布及与致病力的关系[17]。HIS和iNOS基因敲除小鼠因造模时要求的技术平台较高，往往无法满足实验过程中检测多个指标时对小鼠数量的需求。若伤寒沙门菌动物模型与活体成像技术结合，可在动物体内实时动态追踪感染的各个阶段，能减少实验动物数量并降低个体间差异。随着科技的发展，无论是伤寒沙门菌发光技术，还是活体成像系统仪器本身都有进一步的完善[18,19]，可为深入探讨伤寒的发病过程及防治提供更多有价值的信息。

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