结核病实验诊断技术

范齐文，吴文娟

同济大学附属东方医院医学检验科，上海 200120

被称为白色瘟疫的结核病(tuberculosis)是伴随人类历史最长的疾病之一，也是由单一致病菌引起死亡最多的疾病。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)最新报告[1]，2010年有大约880万例新发结核病，145万例死于该病。加快结核病诊断速度、提高检测的敏感度和特异度，是控制结核病疫情的关键。结核病诊断的理想方法应是快速、特异、敏感，广大地区和人群可以接受，能区别活动性与潜伏性结核病，能辨别结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和环境中的非结核分枝杆菌及卡介苗(bacillus Calmette-Guerin, BCG)，且不需昂贵仪器和专业培训[2]的方法。WHO[3]提出了结核病诊断研究努力的方向：通过提高检测的敏感度和特异度达到简化和改进结核病(包括痰涂片阴性结核病、肺外结核病及小儿结核病)的诊断；建立并推广简单、准确、安全、廉价并能快速得到结果的即时检验；能更有效地监测结核病的治疗；能快速检测出是否对一线和二线抗结核药物耐药；能可靠鉴别潜伏感染并能评估发展为活动性结核病的风险，以实施合理的预防性治疗。现就近年来WHO和美国食品药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)认可的几种诊断试剂及新近发展的有应用前景的诊断方法作一综述。

1 WHO认可的3种检测技术

1.1 液体培养

1993年，美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)提出结核病诊断标准，推动了结核分枝杆菌培养自动化技术的发展，第1个自动化诊断结核分枝杆菌感染的是半自动BACTEC 460系统。但由于该系统是通过检测辐射信号实现结核病诊断，故存在一定的辐射污染；并且由于有手工操作，因此增加了操作人员感染及标本交叉污染的风险。随后，一些非辐射结核分枝杆菌检测系统相继面世，如BacT/Alert 3D、ESP Trek、MGIT 960系统等[4]，其中BacT/Alert 3D、MGIT 960系统获得WHO认可[3]。

1.1.1BacT/Alert3D系统BacT/Alert 3D系统是由Organon Teknika 公司研制生产的，为全自动结核液体培养和检测系统。其原理如下：该系统中有许多装有肉汤培养基的小瓶，当有结核分枝杆菌生长时会释放大量CO2，从而降低培养基pH值，使瓶底的传感器颜色发生变化，该变化会被系统内的反射元件捕捉检测；BacT/Alert 3D 系统每10 min自动读取1次结果，读取的数据会自动转换并存储到数据处理系统。此系统密闭，样本接种后没有交叉污染，无放射性[5]。

与固体培养基相比，BacT/Alert 3D系统大大加快了结核分枝杆菌分离的速度，缩短了诊断时间[6]。除能快速从临床标本中分离出结核分枝杆菌外，BacT/Alert 3D系统还可进行抗结核药物的药敏试验。有相关文献[7,8]对该系统的耐药检测与BACTEC 460系统进行对比，结果显示其一致性无明显差异，表明BacT/Alert 3D系统可作为快速、简便检测结核分枝杆菌及其耐药性的先进技术。

1.1.2MGIT960系统MGIT 960系统是美国BD公司于1996年研制的全自动快速结核分枝杆菌培养鉴定药敏仪。该仪器[9]利用荧光检测实现结核分枝杆菌的鉴定和分离：在MGIT培养管底部包埋了钌的五水合物氧传感器，有结核分枝杆菌生长时会消耗管内氧，氧浓度降低引发荧光产生。MGIT 960系统荧光强度记忆探测器每隔60 min监测培养管内的荧光强度，通过处理得出阳性结果。MGIT 960 可在1～2周内获得结果，大大缩短了检测周期[9,10]。

随着结核分枝杆菌耐药问题的日益加剧，其耐药性检测对结核病的治疗显得尤为重要。近年来有相当多文献[11-14]报道用MGIT 960系统评估结核分枝杆菌对一线和二线抗结核药物的敏感性及特异性，并建立了一线和二线抗结核药物的临界浓度，从而更好地指导临床用药治疗。2010年WHO推荐使用液体自动培养法作为二线药物药敏试验的金标准。

MGIT 960系统虽然具有自动化程度高、无辐射危害、阳性分离率高、检测所需时间减少，且可进行药敏试验等优点，但价格昂贵，在结核病高发的发展中国家难以广泛应用，因此限制了其推广。

1.2 分子线性杂交

结核分枝杆菌耐药问题已成为控制结核病的关键，耐多药(multidrug-resistant, MDR)及广泛耐药(extensively drug-resistant, XDR)结核病患者日益增多，这无疑给结核病诊断带来挑战。由于结核分枝杆菌耐异烟肼[15,16]、利福平[17,18]、链霉素[19]及喹诺酮类药物[20]的分子机制于20世纪末已基本阐明，因此一系列基于分子杂交的结核分枝杆菌耐药检测技术应运而生，如GenoType®MTBDRplus、GenoType®MTBDRsl及INNO-LiPA Rif.TB等方法。

1.2.1INNO-LiPARif.TB方法结核分枝杆菌对利福平耐药是由于编码RNA聚合酶β亚基的基因(rpoB)发生点突变、小片段插入或缺失造成的。比利时的de Beenhouwer等[21]最初利用反向斑点杂交与rpoB基因不同区域进行杂交，然后根据杂交条带判读结果以检测耐利福平结核分枝杆菌。后来此技术演变成商业化应用的既能分辨结核与非结核分枝杆菌群，又能同时检测利福平耐药的INNO-LiPA Rif.TB 技术。固定在膜上的5种野生型探针(S1～S5)部分重叠覆盖整个rpoB基因，并与野生型的基因序列发生特异杂交反应，这些探针能检测突变的存在，但不能提供具体的突变位点；另外4种突变型探针(R)能与4类最常见的突变序列杂交。如果是利福平敏感菌株，会与野生型探针发生杂交而产生相应的阳性信号条带；如果是利福平耐药菌株，相应地会在至少1个耐药型探针条带上出现阳性信号。

有相关文献[22]报道，用INNO-LiPA Rif.TB方法检测培养利福平耐药结核分枝杆菌的敏感度达96.2%。从技术上讲，该法只能检测耐利福平菌株，但在结核病高发国家，高达90%的耐利福平分离菌株同时也对异烟肼耐药[23]。利福平扮演着耐多药结核分枝杆菌检测靶标的代言人，故INNO-LiPA Rif.TB可用于耐多药结核病的初步筛查。

1.2.2GenoType®MTBDRplus及GenoType®MTBDRsl方法GenoType®MTBDRplus及GenoType®MTBDRsl由德国Hain Lifescience公司生产，分别检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平和乙胺丁醇、氨基糖苷类及喹诺酮类药物的耐药性，其原理与INNO-LiPA Rif.TB相似，都是将多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)结合反向杂交技术，与固定在硝化纤维膜条带上的特异基因杂交，最后根据显色条带判断是否耐药。这2种方法可通过杂交条带的显色判断突变位点所在。

应用该技术检测结核分枝杆菌的耐药性，可在6 h内获得结果，真正实现了结核分枝杆菌的快速检测。目前已有大量文献对其进行了评价，检测效果几乎可与表型结果相媲美[24-28]。由此可见，GenoType®MTBDR技术是一种快速、简便、有效检测耐多药结核分枝杆菌的工具。GenoType®MTBDRplus在2012年推出了GenoType MTBDRplus 2.0，更新的试剂盒可直接用来检测痰涂片阳性和痰涂片阴性标本，实现了耐多药结核分枝杆菌的筛检。同时在操作上更加人性化，从原来需使用者配置PCR反应体系变为直接向体系中加入模板即可。GenoType MTBDRplus 2.0的推出，必将使耐药结核病的筛查更加快速、准确。

1.3 条带式菌种鉴定

MPB64免疫色谱法(MPB64-immunochromatographic assay，MPB64-ICA)是一种快速、简便鉴别结核与非结核分枝杆菌的方法，其原理是通过抗原-抗体反应检测结核分枝杆菌在液体培养时分泌到培养基中的MPB64抗原。MPB64又称MPT64，只存在于5种BCG亚株及结核分枝杆菌复合群的培养滤液中，类似于纯化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)，能诱发强烈的迟发型超敏反应[29,30]。针对以上特点，一种基于抗MPT64单克隆抗体的试剂盒Capilia TB被应用于结核分枝杆菌的分群鉴定。该试剂盒结构简单，是将与胶体金结合的抗MPT64鼠单克隆抗体固定在硝化纤维膜上，检测MPT64抗原15 min即可报告结果。传统的分枝杆菌分型要培养阳性后做相关生化实验，最终获得结果需几天至几周，而Capilia TB试剂盒只需在液体培养或固体培养阳性后当天得到结果，快速、简便，为后续临床治疗节省大量时间。

2 美国FDA批准通过的3种检测方法

2.1 Gen-Probe分子生物学诊断

Gen-Probe是由美国San Diego基因探针公司研制并获FDA认可的结核分枝杆菌分子生物学诊断产品，可同时检测抗酸染色阳性/阴性的痰液标本。Gen-Probe分子生物学诊断以rRNA为靶物，根据需要可采用Amplified MTD®Test直接扩增试剂盒或AccuProbe探针检测试剂盒，完成结核与非结核分枝杆菌检测、鉴定。Amplified MTD®Test 以反转录扩增技术为主导，以rRNA为扩增靶物，通过30 min快速等温扩增，2.5 h内完成结核分枝杆菌检测全程操作。AccuProbe结合DNA探针的高灵敏度及特异度，采用杂交保护法，以化学发光信号检测特异种属DNA，1 h内以单一菌落鉴定分枝杆菌种属，特异度、灵敏度接近100%。美国CDC推荐DNA探针为鉴定结核分枝杆菌的标准方法。

2.2 AMPLICOR® MTB试验

罗氏AMPLICOR®MTB试验利用PCR扩增分枝杆菌16S RNA中一段长584 bp的片段，该片段存在于所有分枝杆菌内，再用针对结核分枝杆菌复合群的DNA探针与扩增子杂交进而检测。特殊的是，该试剂盒将DNA探针包被在微孔板上，利用生物素-辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺底物系统反应显色，加入氢硫酸终止反应后在450 nm波长读取吸光度(A)值。A≥0.35判为阳性。

AMPLICOR®MTB试验通过在扩增体系内用dUTP替代dTTP及加入尿嘧啶-N-转葡萄糖激酶(AmpErase®)来克服PCR污染[31]，可为临床、实验室及感染控制部门提供快速、有价值的结核病诊断和控制所需的临床相关信息。此法操作简便，约6.5 h即可获结果。有文献[32]报道，用AMPLICOR®MTB检测肺结核患者痰涂片阴性及肺外结核病的敏感度分别为88%、50%，特异度和阳性预测值均为100%。美国FDA认可其用于检测抗酸染色阳性的痰液标本。

2.3 基于 γ干扰素释放试验的2种商业化结核检测试剂盒

潜伏性结核病感染的诊断曾依靠结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)，但其敏感度和特异度都较低，且不能区分BCG接种干扰，特别是对儿童、老年人及免疫系统受抑制人群，检测结果更不尽如人意[33]。近年来出现的以检测CD4+T细胞分泌的γ干扰素为原理的T-SPOT.TB检测试剂盒和QuantiFeron-Gold test (QFT) 试剂盒，能高效检测潜伏结核分枝杆菌感染和活动性结核病，其敏感度和特异度都显著高于TST。这2种试剂盒都是利用结核分枝杆菌RD1区域编码的6 kDa早期分泌抗原靶分子蛋白(6 kDa early secretory antigenic target，Esat-6)和10 kDa培养滤液蛋白(10 kDa culture filtrate protein，Cfp10)的肽段作为特异性抗原，刺激T细胞释放γ干扰素[34]，再分别通过酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)试验和全血酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测γ干扰素水平来判断是否存在结核分枝杆菌感染。与TST相比，这2种方法不需要进行患者随访，24 h内即可获结果，并且不会像TST因反复实验而影响结果。T-SPOT.TB和QFT试剂盒目前均已获美国FDA批准用于检测临床标本。对这2种方法的比较，有文献报道T-SPOT.TB法较QFT法更灵敏[35]，但两者均不能区别潜伏感染与活动性结核病。

3 其他检测技术

3.1 结核分枝杆菌快速诊断噬菌体法

众所周知，噬菌体感染宿主细胞后在细胞内扩增繁殖，达到一定量后将宿主细胞裂解并释放到细胞外，继续感染其他宿主细胞。有研究人员[36]利用分枝杆菌噬菌体D29感染结核分枝杆菌，受感染的结核分枝杆菌因噬菌体的扩增破坏而裂解。随后向培养液中加入快速生长的耻垢分枝杆菌并倾倒成固体培养基平板，噬菌体随耻垢分枝杆菌生长不断重复“感染—复制—裂解”过程，最终在平板上形成噬菌斑，根据噬菌斑数量可推算出最初的结核分枝杆菌数量。在此研究基础上，英国Biotec Laboratories Limited公司研发出FASTPlaque TBTM试剂盒，用于检测结核分枝杆菌及其对利福平的耐药性。第1代FASTPlaque-RIFTM及FASTPlaque-MDRiTM只能应用于结核病临床标本的分离株，如今的FASTPlaque-ResponseTM可用来直接检测临床标本[37]。该法检测结核分枝杆菌周期短，48 h即可获结果；操作简便，不需特殊仪器，适用于一般实验室。

3.2 发光二极管荧光显微镜

用普通显微镜观察抗酸染色后的痰标本是结核病诊断的标准程序，但其敏感度和特异度都较低，荧光显微镜的应用大大提高了阳性检出率，且简便、快捷。但荧光显微镜也存在一些弊端，如汞蒸气短弧光灯的使用寿命较短(200～300 h)，且供应渠道较困难，需长时间预热和降温，需经常维护保养，需暗室等，这些在不同程度上限制了其应用，尤其是在结核病高发的发展中国家[38]。2007年，Lawrenceville公司推出了Lumin发光二极管(light emitting diode, LED)，只需将其替换普通光学显微镜的目镜就相当于一台荧光显微镜，组装的“荧光显微镜”不但克服了上述所有不足，还具有一些新的优点：LED的使用寿命可达30 000 h；使用电池就能维持正常工作；不产生紫外光而保护操作者；分辨及聚焦能力更加强大等[38,39]。根据WHO建议，普通显微镜检测结核分枝杆菌时需放大1 000倍，至少观察100个视野(通常为300个)，而LED荧光显微镜只需在放大400倍观察50个视野即可，既节省时间又大大减少工作量。由于目前对LED报道的文章较少，用其检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度还有待更多实验验证。

3.3 Xpert® MTB/RIF自动检测系统

最近由Cepheid公司研发推出Xpert®MTB/RIF系统，应用于结核病诊断及耐药检测。该系统集众多功能于一身[40-43]：不仅可直接从临床标本中诊断结核分枝杆菌的存在，还可同时检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性，从标本处理、DNA提取、半套式实时PCR扩增结核分枝杆菌复合群耐利福平基因rpoB到结果分析，都由Xpert®MTB/RIF系统完成，需要手工操作的只是将标本加入每个一次性塑料囊筒，完全实现了结核病诊断的自动化。从加入标本到获得结果全程只需2 h，真正达到结核病诊断简便、快捷的要求。Xpert®MTB/RIF系统通过扩增结核分枝杆菌rpoB基因中长为81 bp的耐药决定区，然后对PCR产物进行探针杂交来判断是否对利福平耐药，大约95%利福平耐药株的突变基因都位于该耐药决定区[43]。该系统主要由2部分组成[43]。①Xpert®MTB/RIF塑料囊筒：该囊筒内包含处理后的液态临床标本、PCR缓冲液及低压冻干的实时PCR反应试剂；②GeneXpert 仪器：该仪器控制囊筒内的流体学并进行实时PCR分析。多篇文献已对该系统进行了评价，其检测结核分枝杆菌及对利福平耐药的敏感度和特异度均达到98%以上，即使涂片阴性培养阳性的标本检测也达到72.5%[41]。2010年，WHO[44]推荐应将Xpert®MTB/RIF作为疑似耐药及人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)相关结核病患者的首选筛查方法。

Xpert®MTB/RIF系统一经面世，因其显著的优点如操作简单、无需太多培训、不易造成交叉污染、对生物安全性要求低、对涂片阴性肺结核患者的敏感度高、能快速得出结果等引起了众多研究人员的关注。但该系统检测费用相当昂贵，目前难以在我国推广应用。如能在经济欠发达的结核病高发国家和地区普及使用，必将给结核病的诊断带来革命性的突破。

4 结语

现有的各结核病诊断技术相互之间并没有任何相斥现象。如分子线性探针试验、快速药敏试验等只适用于抗酸杆菌涂片阳性样本检测，而对涂片阴性样本，仍需开展常规培养。在现有的固体培养及药敏试验基础上，WHO将液体培养及分子线性探针试验作为检测二线抗结核药物敏感性的国际金标准。基于分子检测系统具有高敏感度、特异度，简便快速，但检测费用昂贵的特点，结核病诊断的突破口应是如何降低检测成本而达到检测方法推广普及。另外，结核病诊断操作的规范化、仪器试剂的标准化也是需解决的问题。

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