开窍醒脑颗粒对缺血性脑卒中模型大鼠炎症因子的影响

王舒舒，龙子江，陈 明，刘金林，司文文，祝 浩

（安徽中医学院药理教研室，安徽合肥230038）

脑血管病是第一位的致残原因和第二位的致死原因［1］。随着现代科学及诊疗技术的进步，人们对中风病因病机的研究有了更进一步的发展。本课题研究的开窍醒脑颗粒，是一种中药复方制剂，旨在通过观察开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠的预防保护作用，考察其治疗效果，探究其可能的作用机制，充分发挥中医药多途径、多层次、多靶点的综合治疗效果的特点，以期达到对脑卒中更好的防治效果［2］。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠120只，雌雄各半，体重240 g～260 g。由南京医科大学动物中心提供，许可证：SCXK（苏）2007-0004。

1.1.2 实验药物 受试药物：开窍醒脑颗粒（安徽中医学院药理教研室）；阳性药物：华佗再造丸（广州奇星药业有限公司，批号：9350）；血栓诱导剂：凝血酶（SIGMA，批号：T-4648）；甲醛溶液（上海溶剂厂，批号：98019）；枸橼酸钠（上海星火制药厂，批号：50301）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司生产，批号：T20060331）；IL-1β ELISA 试剂盒、IL-6 ELISA 试剂盒、TNF-αELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司，批号：XS201009241、XS201009654、XS201009498）；其余普通试剂由安徽中医学院药理教研室提供。

1.1.3 实验仪器 800型电动离心机：江苏国胜实验仪器厂；电子太平：上海天平仪器厂；Anke TDL-5台式离心机：上海安亭科学仪器厂生产；精密电子天平：日本AND益R-12。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 取120只SD大鼠，适应性饲养1 w后，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（华佗再造丸，0.72 g/kg）、开窍醒脑颗粒低（1.08 g/kg）、中（2.16 g/kg）、高（4.32 g/kg）剂量组。各组大鼠按照上述剂量连续灌胃给药7 d（1 mL/100 g体重），每天1次，假手术组及模型组给予等容量的生理盐水。末次给药后40 min，按照上述方法制备大鼠实验性脑卒中模型，次日继续给药［3］。

1.2.2 模型制备方法 大鼠禁食12 h，末次给药后40 min，用3.4%水合氯醛以1 mL/100 g体重的剂量腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上。颈正中部纵向切开皮肤，切口长约2 cm，游离出右侧颈总动脉，从颈总动脉分叉处向上分离颈外动脉和颈内动脉。结扎颈外动脉，然后向颅底方向分离颈内动脉，在颅底处分离出翼腭动脉，并结扎其根部，仅保留颈内动脉入颅底主干；结扎颈总动脉，暂用2只微型动脉夹间隔一定距离夹闭颈内动脉，在近心端颈总动脉处用眼科剪剪一小口，插入导管（内已抽好血栓诱导剂凝血酶10 μL加生理盐水0.05 mL）固定后，移去近导管端血管夹，少量血液流入导管头端，放置约10 min形成一小血栓；然后移去另一只血管夹，缓慢将此血栓和凝血酶注入颈内动脉后，拔出导管，并将颈总动脉切口处结扎，缝合切口；术后单笼饲养。假手术组手术操作过程同上，只是不注入血栓和凝血酶，而注入等量生理盐水。

1.2.3 组织取材及检测指标 术后24 h，用水合氯醛腹腔注射（3.4%，1 mL/100 g体重）麻醉，仰卧位固定，取各鼠脑组织进行相关指标的检测。

1.2.4 组织形态学观察 每组随机取10只动物，处死并立即在冰盘内开颅取脑，将脑组织置于10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，置于光镜下，观察大鼠脑组织病理形态学变化。评分标准：（-）无病变 0 分；（+）轻度病变 1 分；（++）中度病变2分；（+++）重度病变3分。

1.2.5 脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量测定 取剩余10只大鼠新鲜的脑组织，称重后放入盛有PBS的试管中，保存在-80℃冰箱备用。取保存在-80℃冰箱中脑组织块，冻融后用冷生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干，放入玻璃匀浆器加入少量的生理盐水（0.5 mL～1.0 mL），上下转动碾磨数十次使组织匀浆化。最后再加适量生理盐水配成30 g/L脑组织匀浆，将匀浆以4000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平，按试剂盒使用说明书操作。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织形态学影响

结果见表1、图1。

表1 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织病理变化的影响 （±s）

注：与假手术组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01

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图1 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织形态学影响病理照片

由表1可见，与假手术组比较，脑卒中模型组大鼠脑组织水肿、胶质肿胀以及炎细胞浸润程度显著增强（P<0.05，P<0.01），说明模型组大鼠脑损伤严重；开窍醒脑颗粒高、中、低剂量组与模型组比较，脑组织各种病变显著缓解（P<0.05，P<0.01），能显著降低中风大鼠脑损伤程度，对大鼠血栓导致的中风损伤有保护作用，并随剂量增加作用增强。

镜下病理观察可见：大鼠脑血栓形成后，镜下观察假手术组脑组织结构正常，神经元分布规则，数量正常，神经胶质细胞不肿胀，脑组织除个别有轻度充血外其余均无充血水肿。模型组可见大小不等梗死灶形成，梗死灶形态不规则，梗死灶区神经元大多数变性坏死或消失，胶质细胞肿胀，体积增大，脑组织充血水肿，边缘区可见炎细胞浸润。阳性药物组及开窍醒脑颗粒高、中、低剂量组少数仍有梗死灶发生，但面积较小，多数不发生梗死，神经元分布及数量也基本正常，胶质细胞肿胀也不明显，脑组织充血水肿很轻，炎细胞浸润较不明显。

2.2 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α 含量的影响

结果见表2。

表2 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影响 （±s，ng/L）

表2 开窍醒脑颗粒对脑卒中模型大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影响 （±s，ng/L）

注：与假手术组比较，1）P<0.05，2）P<0.01；与模型组比较，3）P<0.05，4）P<0.01

组别 n I L-1 β T N F-α I L-6假手术组 60.3860±0.0687 0.3468±0.0269 0.6838±0.0651模型组 60.4702±0.0222 1） 0.4340±0.0265 2） 0.7820±0.0387 1）阳性对照组 60.4083±0.0046 4） 0.3645±0.0332 4） 0.5113±0.0369高剂量组 60.4112±0.0089 4） 0.3657±0.1889 4） 0.4694±0.0497 4）中剂量组 60.4217±0.0116 4） 0.3788±0.0225 4） 0.4058±0.0144 3）低剂量组 60.4315±0.0069 4） 0.3962±0.0147 3） 0.3713±0.0531 4）

由表2可知，与假手术组比较，模型组大鼠TNF-α、IL-1β含量明显增高，IL-6含量明显下降，差异有统计学意义。与模型组比较，开窍醒脑颗粒高、中、低剂量组脑组织中TNF-α和IL-1β含量明显降低，IL-6含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨论

近几年的研究发现，脑卒中后血肿内和血肿周围存在明显的炎症反应，并表达多种细胞因子，主要包括白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核因子-κB（NF-κB）等［4］。这些细胞因子在脑卒中后脑损伤的病理过程中扮演着重要角色［5］。①TNF-α是体内最主要的炎性介质之一，是具有多效性作用的促炎性细胞因子［6］。脑卒中炎症反应的核心是TNF-α在血液中的激活。TNF－α在脑炎症活动中起着重要的作用，它能影响血管内皮细胞活性并对血管炎性过程起到调节作用，可以促进细胞黏附因子在内皮细胞的表达，引起白细胞黏附、聚集并从毛细血管迁移至脑，从而对继发性脑损伤起到关键的促发作用，导致脑血栓以及炎症反应的加重［7］。②IL-1β是炎症细胞的强烈趋化因子，是血浆和组织液中的主要分泌形式，也是脑组织中的主要形式，参与周围免疫反应。IL-1β能够协同其他细胞因子活化B、T细胞，促进白细胞与内皮细胞黏附，诱导和促进脑缺血后炎症介质对脑组织的损伤，损伤神经元［8］。③IL-6被视为一种与中枢神经系统缺血相关的重要炎症反应分子。通常情况下，正常血浆中含有的IL-6量很少，只有在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，IL-6的含量会上升。IL-6与IL-6R形成复合物后，就可作用于表达模型gp130分子的细胞，引起生物学效应［9］。IL-6可以抑制IL-1和TNF-α的合成，并能刺激产生它们各自的循环拮抗剂-可溶性肿瘤坏死因子-α受体（sTNF-αR）和白介素-1受体拮抗剂（IL-1RA），从而对抗IL-1和TNF-α所致的炎症损伤。因此IL-6在脑缺血急性反应期发挥了重要的抗炎作用。开窍醒脑颗粒可升高IL-6含量，保护脑组织，其作用机制有可能在于促进 IL-6 对抗 TNF-α、IL-1β 等其他炎症因子［10］。

脑血栓形成后，血液中包含的大量炎症因子流到脑组织，进一步加重脑血栓后的损伤［11］。从实验结果可以看出，开窍醒脑颗粒对脑血栓引起的中风形成的炎症因子有抑制作用，通过降低炎症因子的含量，进而抑制级联反应发生等机制来保护脑组织。这就进一步验证近年来从炎症角度出发对血栓性中风疾病的研究是有现实意义的，同时为临床中药治疗脑缺血病提供了实验依据。

脑血栓是脑血管病中的急重症，属中医学中风、卒中范畴。自《黄帝内经》后，历代医家对其病机进行了完善，多认为阴虚血瘀、气虚血滞是导致脑血栓的始动因素。因此，破血逐瘀是脑血栓的基本治法。开窍醒脑颗粒为中药复方制剂，由水蛭、人参、郁金、石菖蒲、桂枝、人工牛黄等组成。方中水蛭破血、逐瘀、通经；人参大补元气，复脉固脱，补脾益肺；郁金活血止痛、行气解郁、清心凉血、疏肝利胆。几味药合用共奏破血逐瘀、息风开窍之功。现代药理研究表明，水蛭具有抗凝、抗血栓、保护缺血再灌注损伤、降压、降脂及改善血流变等作用；人参皂苷可加快脂质代谢，行了正交优化研究，采用L9（33）正交表进行正交试验，试验设计及结果如表3所示。

表3 正交试验设计及结果

由表3的极差分析可知，3种因素的最佳组合为A2B3C2。从表3计算的K值可以知道，最佳水平组合为A3B3C3，因此用A3B3C3做验证性试验，即浸提温度90℃、料液比 1∶40、浸提时间 2.5 h，试验结果为聚合草提取液中黄酮类物质含量是3.01%。所以最终确定最佳的提取工艺条件为A3B3C3。

3 讨 论

通过单因素试验和正交试验，确定聚合草黄酮类物质的最佳提取工艺参数为：浸提温度90℃、料液比1∶40、浸提时间2.5 h，在此提取工艺条件下聚合草提取液中黄酮类物质含量为3.01%。且该方法设备简单，操作简便，是一种较为理想的提取方法。不仅黄酮含量高，像蛋白质和多糖等其他物质含量也很高。在今后的开发利用过程中，我们可以尝试对该草中的各种物质进行提取做一些保健和美容的产品。

［1］齐宗国，姜凤霞，霍永智.聚合草（俄罗斯饲料菜）引种栽培实验［J］.草原与草坪，2004（2）：48-51.

［2］卢隆杰，王桂泽，卢传盛.聚合草——俄罗斯菜的特性及开发利用［J］.江西饲料，2004，6（4）：19-21.

［3］杨玉琼，王伟，华高民，等.杜仲叶中黄酮提取、检查方法研究进展［J］.中药材，2009（2）：875-879.

［4］程力惠，李晓蒙.贯叶连翘中总黄酮提取工艺的研究［J］.中药材，2008，22（6）：904-907.