MiR-451在肺癌细胞A549及肺癌癌组织中的表达及其意义

张继琛，娄 凯，闫李侠 (浙江省台州市第一人民医院，温州医学院附属黄岩医院，浙江 台州 318020)

微小RNA(miRNA)是一种小的非编码RNA，与靶mRNA的3'UTR完全或者不完全结合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻译。miRNA与细胞增殖、分化、凋亡、造血调控和脂肪代谢等过程密切相关。微小RNA(microRNA)是一类长约22nt的非编码RNA，在转录后水平调控基因的表达。大量实验表明miRNA参与了细胞增殖、分化和凋亡，在肿瘤的发生、发展过程中起重要的调控作用［1］。近来，microRNA－451(miR－451)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌研究中均有报道［2－4］，但在肺癌方面报道较少，为探讨miR－451在肺癌发生、发展过程中发挥的作用，笔者在体外验证miR－451在正常肺细胞株及肺癌细胞株的表达差异，通过临床标本检测该小分子在正常肺脏组织、癌旁组织及肺细胞癌中的表达，为进一步探讨miR－541在肺癌发生发展中的作用机制奠定基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料:培养基高糖DMEM购自Hycolone公司，胎牛血清为美国Gibco公司生产。Bulge.100p1M miRNA定量聚合酶链反应(PCR)引物试剂盒购于广州锐博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录(RT)试剂盒购自ToYoBo公司，PCR试剂盒购自Fermentas公司;其他试剂皆为分析纯。CCK.8试剂盒购自苏州碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染:NSCLC肺癌细胞株A549由中国科学院上海细胞生物研究所提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5%(体积分数)CO2:培养箱中培养。将细胞消化后种于96孔板，待细胞密度达到30% ～50%采用lipo－2000脂质体将不同浓度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－451模拟物及阴性对照转入细胞中，每组6孔，转染后0、24 h、48 h、72 h分别采用 WST－8测定细胞存活率并绘制生长曲线，试验重复3次。

1.2.2 组织来源及患者特点:共有组织35例，患者年龄45～75岁，所有病例组织来自于温州医学院附属黄岩医院胸外及呼吸内科，标本取自手术切除肺癌组织、肺癌周围组织以及肺癌周围正常肺组织。①肺癌组织:取自实性癌中未坏死的区域。②癌周组织:肺癌周围2 cm以内的未坏死组织。③正常肺组织:肺癌周围3 cm以外的未坏死组织。所有患者术前未接受任何抗肿瘤药物治疗，未进行介入治疗。组织标本离体后，立即放入液氮冷藏，－80℃保持备用。

1.2.3 实时定量PCR检测miR－451表达水平:①总RNA的提取:收取细胞沉淀后直接用Trizol重悬，组织加入1 ml Trizol后用匀浆器研磨，加入200μl氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置10 min后，12 000 r/min，4℃离心15 min，吸取上层水相加入等体积预冷的异丙醇，置于－20℃冰箱30 min以上;再采用12 000 r/min，4℃ 离心 15 min，弃上清，75%乙醇(无 RNA 酶水配置)漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。根据Bulge－LoopTMmiRNA定量PCR引物试剂盒说明书操作，取2μg总RNA，加入内参U6及目的小分子RNA miR－451逆转录引物，70℃ 10 min，混合物取出后立即置冰上，冰育2 min，随后加入逆转录其他试剂。RT反应程序为:42℃ 60 min，70℃10 min。RT反应结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，置－80℃备用。②实时定量PCR:以逆转录产物为模板，在实时定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR扩增体系:10μg 2×SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)，10 μmol/L 5'及3'引物0.5 μl，1 μl逆转录产物，加灭菌双蒸水至20μl。反应条件为:95℃预变性1 min，95℃ 15 s，60℃20 s，70℃ 10 s，共40个循环。溶解曲线反应条件:95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。采用相对定量方法计算靶miRNA相对表达量，计算公式为:相对miRNA表达量=2－(⊿Ct样品－⊿Ct对照)。Mir－451及其内参U6的引物购于购于广州锐博生物科技有限公司。③CCK－8试剂盒检测细胞增殖:待测细胞96孔板每孔加入10μl CCK－8溶液。同时用加了相应量细胞培养液和CCK－8溶液，但未加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱内继续孵育0.5～4.0 h。采用酶标仪在450 min波长处测定A值。

1.3 统计学分析:数据采用SPSS 17.0统计软件分析，数据均采用均数±标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR－451在正常胚肺细胞株及肺癌细胞株中的表达:mir－541在肺癌细胞(A549)中的表达比正常肺细胞显著降低(0.294±0.066、0.894±0.023)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 miR－451模拟物抑制肿瘤细胞的增殖:分别给予肺癌细胞株 A549不同浓度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－145模拟物处理后，不同浓度均可使其增殖能力明显减弱，5 nmol/L可出现抑制作用，10 nmol/L效应明显，但10 nmol/L同20 nmol/L效应无显著差异，故采用10 nmol/L浓度处理细胞后进行不同时间点细胞增殖能力检测。细胞增殖在24 h即出现明显抑制，72 h仍有抑制效应。

2.3 miR－145在正常组织、癌周组织、癌组织中的表达:在癌组织中表达显著低于正常组织与癌周组织(0.124±0.002、0.870±0.034、0.896±0.008)，差异有统计学意义(P＜0.05)，前者降低7倍(P＜0.05)，正常组织及癌周组织比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

miRNA在细胞的增殖、分化等方面发挥着重要的调节作用。多种miRNAs与肿瘤发生及发展过程密切相关，miRNA通过调节其靶mRNA的表达发挥促进或者抑制肿瘤进展的作用。作为转录后水平调控基因表达的关键因子，该小分子的出现对肿瘤发生机制的阐明、肿瘤治疗及预后均具有重要意义。miR－451为众多小分子RNA中的一员，miR－451位于染色体17q 11.2，与原癌基因人类表皮生长因子受体2的17q 11.2－21区域临近［5－6］。然而，miR －451在肿瘤方面作用的研究尚处于初级阶段。2005年Ahuvia等首次发现miR－451［7］。2009年Bandres等研究发现miR－451与预后不良相关［4］。与无瘤组织相比，原位杂交显示胃癌和结肠癌上皮细胞miR－451表达降低。胃癌细胞AGS和结肠癌上皮细胞DLDI。miR－451过表达则降低细胞扩增及增加放射敏感性。微阵列及生物信息学分析鉴别出新的致癌基因巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是miR－451的潜在靶点，而MIF是参与肿瘤侵袭、转移的重要因子［8－9］。2010年 Godlewski等研究 miR －451表达对脑胶质瘤迁移的影响［10］。2007年Brueckner等研究发现miRNA－451在支气管肺泡干细胞保持自我更新能力中发挥重要作用，深入研究发现miR－451通过影响细胞骨架而调控迁移［11］。在肺癌与miRNA研究中，2011年兰海等研究在非小细胞肺癌中高表达的miR－21对肿瘤细胞的增值和凋亡有重要调节作用，抑制肿瘤抑制基因程序性细胞死亡因子4的表达［12］。Chen等研究将miR－145转染至非小细胞肺癌细胞后，癌细胞的原癌基因c－myc表达下调，增殖受到抑制［13］。

本研究结果表明，miR－451的低表达在肺细胞癌的发生、发展中可能发挥着重要作用，它可能作为肺细胞癌恶性行为的重要标志，同时也为治疗及预后提供一些理论基础。

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