类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞DcR3基因表达水平的分析

孙可歆 李春辉 郭素红 李正祎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明的自身免疫性疾病，以慢性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现。诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3)是近年来新发现的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的新成员。DcR3是能和肿瘤坏死因子超家族成员FasL、LIGHT以及TL1A相结合，对细胞凋亡起负调控的作用，在肿瘤免疫、自身免疫中发挥着重要的作用［1，2］。目前研究表明:在某些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、矽肺患者的外周血单核细胞(PBMC)中 DcR3基因可呈高度表达［3，4］。本研究采用实时荧光定量PCR法对RA患者PBMC中DcR3 mRNA表达水平进行了检测和比较，探讨DcR3在RA免疫紊乱过程中所起的作用，为进一步阐明RA的免疫机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集北华大学附属医院2012年6月至2012年12月住院和门诊RA患者40例，男性8例，女性32例，年龄16～65岁平均年龄35岁±12岁。所有RA患者均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA分类标准［9］，28个关节疾病活动度(DAS28)评分为疾病活动度评分标准，40例患者中活动期22例，缓解期18例。健康对照组25例，男9例，女16例，平均年龄年龄(38±10)岁。各组人员均排除其他自身免疫性疾病和严重心肺功能异常者。经统计学检验各组年龄、性别差异无统计掌中宝意义(P＞0.05)。

1.2 仪器和试剂 Trizol试剂(Invitrogen公司)，荧光定量PCR7300(美国ABI公司)，荧光定量 MIX(美国 ABI)，普通PCR(北京博大泰恒生物技术公司)，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制剂公司)，逆转录试剂(Fermentas)，引物燃料探针(北京天一辉远)，低温离心机(索福Biofuge Stratos)。

1.3 方法 ①RNA抽提和cDNA的合成取肝素抗凝的肘静脉血3 ml与PBS以1∶1稀释，混匀后沿管壁轻缓移入放有等体积人淋巴细胞分离液，1500 r/min，15 min，吸取分层液的云雾层，PBS洗涤，计数以1×106个细胞/ml加1 ml Trizol、异硫青酸胍-酚-氯仿提取总RNA。紫外分光光度计检测并计算RNA浓度(浓度μg/ml=A260×40×稀释倍数)和A260/A280比值。cDNA的合成20 μl逆转录反应体系，严格按照说明书操作，反应条件为25℃ 10 min，55℃ 30 min，85℃ 5 min。②实时荧光PCR定量PCR检测PBMC中DcR3 mRNA 表达水平 :20 μl反应体系，10 μl荧光定量 Mix，2 μlcDNA，上、下游引物各 1 μl，6 μl水;引物序列:β-actin F:5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGA-3’，R:5’-GCGAAGCCGGCCTTGCACAT-3’，120 bp;DcR3F:5’-TCAATGTGCCAGGCTCTTC-3’，R:5’-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3’，144 bp;反应条件:50℃2 min，95℃10 min，(95℃15 s，60℃1 min收集荧光)40 循环，延续 95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s。用荧光定量 PCR7300检测 DcRmRNA表达水平，以DcR3与内参β-actin比值作为DcR3 mRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法 所有统计学处理均采用SPSS 13.0统计软件分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血PBMCs中DcR3 mRNA表达水平DcR3 mRNA与内参β-actin的表达水平二者比值作为DcR3 mRNA的相对表达量。结果显示，RA患者活动期DcR3 mRNA水平高于缓解期和健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);缓解期DcR3 mRNA水平与健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 PBMCs中DCR3 mRNA表达相对量(±s)

表1 PBMCs中DCR3 mRNA表达相对量(±s)

注:*P＜0.01(与缓解期和健康对照组比较)

组别 例数 DCR3/β-actin mRNA RA 活动期 22 0.67 ±0.33*RA 缓解期 18 0.21 ±0.14健康对照组25 0.17 ±0.18

2.2 RA患者外周血DcR3 mRNA与DAS28评分的相关性分析 经pearson相关性分析，RA患者外周血DcR3 mRNA水平与 DAS28评分呈显著正相关趋势(r=0.517，P=0.000)见表2。

表2 RA患者外周血DcR3 mRNA与DAS28 scores相关性分析(±s)

表2 RA患者外周血DcR3 mRNA与DAS28 scores相关性分析(±s)

DAS28 scores DCR3 mRNA r P 值0.517 0.000 RA患者

3 讨论

诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3)是新近发现的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的新成员，主要通过和某些蛋白配体特异性结合，竞争性地抑制配体与死亡受体的结合，从而阻断配体诱导产生的细胞凋亡，在肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫及抗感染免疫中都发挥重要的作用。本研究中，活动期RA患者外周血DcR3 mRNA表达水平显著高于缓解期RA患者和健康对照组，由于DcR3在调节T细胞活化、增殖、分化以及凋亡中起重要作用，可能DcR3基因参与自身免疫性疾病的免疫紊乱［5］。

本研究中还发现，RA患者 DcR3 mRNA表达水平与DAS28评分呈正相关，提示RA患者体内DcR3水平的升高有利于细胞因子分泌模式向Th1方向倾斜［6］，调节T细胞活化，说明DcR3在RA的发病过程中可能起着重要的作用，与疾病的活动性有关。RA患者外周血DcR3的高表达是如何参与RA的发生、发展，为进一步揭示RA的发病发展仍需进一步研究。

［1］Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DV，et al.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer.Nature，1998，396(6712):699-703.

［2］Hsu TL，Chang YC，Chen SJ，et al.Modulation of dendritic cell differentiation and maturation by decoy receptor 3.J Immunol，2002，168(10):4846-4853.

［3］Liw，zhang C，Chen C，et al.Correlation between expression of DcR3 on tumor cells and sensitivity to FasL.Cell Mol Immunol.2007，4(6):455-460.

［4］Otsuki T，Tomokuni A，Sakaguchi H，et al.Over-expression of the decoy receptor 3(DcR3)gene in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)derived from silicosis patients.Clin Exp Immunol，2000，119(2):323-327.

［5］Matyniak JE，Reiner SL.T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease.J Exp Med，1995，181(3):1251-1254.

［6］Herman S，Zurgil N，Langevitz P，et al.Methotrexate selectively modulates TH1/TH2 balance in active rheumatoid arthritis patients.Clin Exp Rheumatol，2008，26(2):317-323.