成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法

赵永星 隗和明 卢君 张广钦

心肌细胞内的钙调控(Calcium handling)对于维持心脏和心肌细胞的正常生理功能有着重要作用。钙调控失常见诸于几乎所有的先天和后天的人类心脏病变，如心脏衰竭，心肌肥厚等［1］。钙成像(Calcium imaging)是目前最为有效的检测细胞内钙调控的技术，钙离子荧光指示剂(Fluorescence calcium indicators)如Fluo-4 AM可以随 Ca2+离子的结合而改变其荧光特性。激光共聚焦显微技术(Laser confocal microscopy)以其高分辨的优势，可以提供更好的细胞内钙离子浓度动态变化的图像，包括钙瞬变和钙火花［2］。

在成年动物的心室细胞中，为了观察细胞钙释放特征，我们常用刺激诱发心肌细胞的钙释放。然而，使用传统的刺激器［3］(如YSD-4GA型生理实验多用仪)诱发心肌细胞搏动时，需在培养皿两端中放置正负两电极于心肌细胞两端(图1)，但在操作时电极之间的距离不稳定，影响细胞收缩的刺激阈电压。我们实验室采用多孔板内置入板状电极构成场刺激的原理，利用C-Pace刺激器成功地诱发多个成年大鼠的心室肌细胞同步搏动，从而建立稳定的测定细胞内钙离子动态变化的方法。

图1 YSD-4GA型生理实验多用仪

1 材料与方法

1.1 仪器和溶液的配制仪器 Ion C-Pace EP刺激器(Ion Optix corporation，USA)。玻璃底6孔板(MatTeK Corporation，USA)，激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM-710，Germany)试剂:胶原酶Ⅱ(CollegaseⅡ)购自Worthington Biochemical公司(USA);HEPES，Glucose，EGTA，牛磺酸和 L-谷氨酸等试剂均购自美国Sigma公司。无钙台式液(mmol/L):NaCl 137，KCl 5.4，MgCl2.6H2O 1，NaH2 PO4 0.33 葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH调pH至7.40。KB液(mmol/L):KCl 40，KH2PO420，MgCl2.6H2O 3，L-谷氨酸50，牛磺酸20，HEPES 10，KOH 80，葡萄糖10，EGTA0.5，用 KOH调 pH至7.40。正常台式液(mmol/L):无钙台式液中加1 mmol/L CaCl2，溶液均用纯氧饱和。

1.2 急性心肌单细胞的分离 成年SD大鼠，雌雄不拘，体重200～300 g。由 SingHealth Experimental Medical Centre(SEMC，新加坡)提供。利用改进的 Langendoff灌流法［4］分离单个成年大鼠心室肌细胞。大鼠腹腔麻醉，迅速开胸取心脏，主动脉插管逆向灌流，先以无钙台式液清洗残留的血液，再灌流含有0.3 mg/ml胶原酶Ⅱ，1 mg/ml牛血清白蛋白和1 mg/ml牛磺酸的无钙台式液继续灌流约30 min后，将心脏组织放入KB液中剪碎吹打，细胞悬液用200目滤网过滤，分离的心肌细胞KB液中保存2 h后，经台氏液梯度复钙至1 mmol/L。

1.3 刺激器的连接及使用C-Pace EP刺激器由三部分组成:8通道刺激器(图2A)，导线和与多孔板匹配的固定板型电极板(图2B)。该系统是具备诸多优点:①它有8个通道，经板上固定电极与玻璃六孔板(四孔板，八孔板皆可)连接(图2C)，可以允许同时刺激8个多孔板。②输出电压的范围达到正负40 V，频率范围在0.01到99 Hz之间，脉冲时间范围在4 ms到24 ms，可以根据实验要求设置所需参数。③支持数字输入和输出。④刺激输出端有短路保护，能承受长时间的短路。⑤刺激器通过导线与电极板和玻璃板相连(图2D)，可以允许培养室门关闭，有利于细胞培养，保持细胞处于良好状态。本实验所用刺激器的参数设置为:10 mV，1 Hz，2 Hz。

图2 C-Pace EP刺激装置

1.4 激光共聚焦扫描显微镜钙成像 细胞在室温下以6 μg/ml的Fluo-4［5］荧光探针染色约15 min，然后将细胞置于每孔含3 ml正常台式液的6孔板中，为使细胞更好的贴壁，玻璃底部提前用Laminin(1 μg/cm2)处理半个小时。选择适合的心肌细胞(细胞横纹清晰呈现杆状，表面干净)进行实验。将板型电极放入六孔板中并与刺激器连接。然后把六孔板置于Carl Zeiss LSM-710型激光共聚焦显微镜上，物镜为40倍油镜，数值孔径为1.3 nA，激发光为功率25 mW的488 nm的氩激光，大于505 nm波长收集发射光，共扫描1000条线，每条线包含512个像素，扫描速度为每条线3 ms。图像以线扫描方式(X-T)进行。实验室温度控制在20℃～25℃。

2 结果

2.1 大鼠心肌细胞的分离通过对装置的改良，以及适当地掌握的消化时间和消化温度，成功的分离出适合做激光共聚焦显微镜的单个大鼠心室心肌细胞。复钙后细胞成活率70%左右，镜下观察，静息状态细胞呈杆状、横纹清晰、遮光性强、细胞无明显自发性收缩(图3)。后续实验表明，该方法分离出的心肌细胞能够满足多种实验的需求。

图3 分离的单个心肌细胞

2.2 心肌细胞钙瞬变的激光共聚焦线扫描在静息状态下心肌细胞很少收缩，但少数细胞有时会出现自发性收缩，产生不规则的钙波(图4A)。当使用刺激时，随着电压的增加，细胞开始出现收缩，随频率出现明显的钙瞬变。参数为1 Hz时，图4B和4C分别是当频率为1 Hz和2 Hz时心肌细胞随频率变化的钙瞬变图像。当加入咖啡因(10 mM)，钙瞬变强度快速明显增加，显示钙库中的钙释放(图4D)。我们可通过分析钙瞬变的荧光强度测量钙释放的量。

图4 钙扫描原始图

3 讨论

心肌兴奋－收缩耦联是从心肌细胞电兴奋到收缩的一个过程。在这个过程中 Ca2+不仅参与心肌电兴奋活动，而且直接与肌丝蛋白结合引起心肌收缩［6］。在疾病状态下，如心肌肥厚，心肌衰竭等，心肌的钙释放异常，心肌兴奋－收缩耦联发生障碍，导致心功能下降［7］。因此，我们通过对心肌细胞钙释放特征的研究，从而探讨疾病的发生机制。在以往的心肌细胞钙信号研究中，刺激电极往往都是根据实验的需要通过自己加工制作，所用材料，电极直径，电极之间的距离不同，使每次实验时诱发钙释放的电压，心肌收缩幅度有较大的差异，其结果的重复性带来较大的误差。C-Pace EP刺激器正在被广泛地应用［8］，相比传统刺激器，该刺激器输出通道多，输出电压和脉冲时间的范围大，输出端有极好的短路保护，刺激电极是固化在面板上。其次，C-Pace EP刺激器操作方便，稳定性高，不依赖正负电极导线，可固定装置在Carl Zeiss LCM710等高端显微镜平台，使每次分离的心肌细胞测定误差较小。最后，基于C-Pace EP刺激器的Ca2+成像法可以在短时间内完成多细胞，多实验组以及不同药物的钙瞬变记录。本次实验中，我们应用C-Pace EP刺激器能够记录到较好的钙瞬变图像，并观察在一个6孔板中测定的钙瞬变的刺激参数等，其结果显示较小的误差。虽然此方法克服了每次实验参数和结果出现的误差，但是应用C-Pace EP刺激器进行钙扫描也有不足之处，我们发现C-Pace EP刺激器的设计缺陷对钙成像造成不便，因电极板在多孔板上面，加大了给药的距离，给药时容易引起细胞外液的波动，使细胞贴壁状态不够好，偶尔会造成焦距的飘移，从而干扰实验的顺利进行。

本实验以激光共聚焦显微镜作为测量手段，配以新型的Ion C-Pace EP刺激器作为辅助工具，易于操作且稳定，重复性高，能满足获得稳定实验结果的需要。本实验方法的建立为各种动物心肌细胞内钙动态变化的测量提供了技术基础。

［1］Kho C，Lee A，Hajjar RJ.Altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling-targetsfor heart failure therapy.Nat Rev Cardiol，2012，9(12):717-733.

［2］Zhang GQ，Wei H，Lu J，et al.Identification and characterization of calcium sparks in cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.PLoS One，2013，8(2):e55266.

［3］王黎敏，祁金顺，李文朝.YSD-4型药理生理实验多用仪波宽、延时的改进.长治 医学院学报，1997，11(1):78-79.

［4］Hoshino S，Omatsu-Kanbe M，Nakagawa M，et al.Postnatal developmental decline in IK1 in mouse ventricular myocytes isolated by the Langendorff perfusion method:comparison with the chunk method.Pflugers Arch，2012，463(5):649-668.

［5］Cheng H，Lederer WJ，Cannell MB.Calcium sparks:elementary eventsunderlying excitation-contraction coupling in heart muscle.Science，1993，262(5134):740-744.

［6］Bers DM.Cardiac excitation-contraction coupling.Nature，2002，415(6868):198-205.

［7］Bing OH，Brooks WW，Conrad CH，et al.Intracellular calcium transients in myocardium from spontaneously hypertensive rats during the transition to heart failure.Circ Res，1991，68(5):1390-1400.

［8］Ahlers BA，Song J，Wang J，et al.Effects of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase overexpression in postinfarction rat myocytes.J Appl Physiol，2005，98(6):2169-2176.