HtrA2在大鼠脑胶质瘤细胞中的表达

宋 宇 魏志玄

南阳医学高等专科学校第一附属医院神经外科 南阳 473000

目前，围绕胶质瘤病因和发病机制的研究非常普遍。其中，细胞凋亡在胶质瘤发病中的作用越来越受重视。HtrA蛋白家族是一类寡聚丝氨酸蛋白酶，作为其成员之一的HtrA2在某些病理或应激状态下释放至胞浆可以激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。HtrA2作为一种前凋亡因子的作用已经在很多研究中得到确认，其活性降低可能导致胶质瘤的发展。本文采用免疫组织化学方法对大鼠胶质瘤中HtrA2的表达进行检测，为进一步研究其在胶质瘤发展中的作用打下基础。

1 资料与方法

1.1 标本与资料 大鼠胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所；SD 大鼠购自湖北省实验动物中心，所用一抗为兔抗Omi／HtrA2多克隆抗体（英国Abcam 公司），封闭剂、二抗、DAB 显色试剂盒（英国Novolink公司），胰蛋白酶购自美国sigma公司；计算机图像分析系统（Leica QWin Image Processing and Analysis System.英国Leica Imaging System Ltd公司）。

1.2 实验方法 （1）采用C6细胞立体定向移植的方法构建大鼠胶质瘤模型，成功后取肿瘤组织标本；（2）采用非生物素检测系统：4mm 石蜡切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，柠檬酸缓冲液微波法修复抗原；（3）加3%双氧水20min，以阻断内源性过氧化酶活性；5%兔封闭血清室温下封闭20 min；加Omi／HtrA2抗体（1∶400），4℃过夜；加第2抗体室温下孵育20min；加链抗亲和素室温下孵育20min；DAB染色，显微镜下观察，满意后终止，封片。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。使用计算机图像分析系统对Omi／HtrA2的免疫组化染色的强度和范围进行定量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。检验水准双侧α＝0.05。

2 结果

HtrA2蛋白在正常大鼠脑胶质细胞和大鼠脑胶质瘤细胞化学染色均有阳性表达（图AB），DAB棕黄色颗粒着色在胞浆中，实验组20 例，18 例阳性表达；正常对照组20 例，1例阳性表达，在脑胶质瘤细胞中表达高于正常脑胶质细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图A：正常细胞；图B：胶质瘤细胞

3 讨论

生理条件下HtrA2是作为线粒体中的分子伴侣而发挥作用，从而促进细胞存活而非凋亡。但在接受某些病理因素或外源性刺激的状态下（如缺血再灌注、某些化疗药物作用、抗Fas抗体或暴露于紫外线的照射），HtrA2可转变为前凋亡因子而发挥促细胞凋亡的作用。成熟HtrA2蛋白的N 端包含一个四肽基序，可与各种凋亡抑制蛋白（IAPs）发生相互作用。当接受到凋亡刺激后，HtrA2 从线粒体释放至胞浆中，并 降 解 各 种IAPs，如XIAP、cIAP1、cIAP2 和Apollon／BRUCE。由于IAPs被分解导致caspase3、7、9激活，从而诱导细胞凋亡［1］。用十字孢碱处理HeLa细胞，观察到HtrA2释放到胞浆中并与一种丝氨酸-苏氨酸激酶WARTS（一种潜在的肿瘤抑制蛋白）结合成复合物。HtrA2-WARTS与XIAP发生作用并将其水解。表达WARTS的HeLa细胞表现出更易受十字孢碱或紫外线的作用而发生细胞凋亡，当其表达成熟的HtrA2时，这种凋亡现象更显著［2］。Gupta等研究HtrA2与神经退行性疾病关系时发现，在淀粉样蛋白b积蓄导致的细胞凋亡过程中有HtrA2的参与。淀粉样蛋白b的积蓄可导致HtrA2释放至细胞质并与早老素1发生交互作用，其 结 果 是 使HtrA2 对XIAP、cIAP1 和cIAP2 的 水 解 活性增强，从而引发神经元产生caspase依赖性的细胞凋亡过程。

HtrA2除可以分解凋亡抑制蛋白IAP之外，还能分解其他一些表现出抗凋亡活性的蛋白质。在细胞接受紫外线照射的条件下，HtrA2与胞浆中的ped／pea15蛋白结合并将其分解。Ped／pea15发挥抗凋亡作用主要是依赖于其能在多个水平上抑制caspase途径的激活。HtrA2分解ped／pea15促进了紫外线介导的细胞凋亡［3］。HtrA2同样裂解抗凋亡蛋白Hax-1，后者是Bcl-2蛋白家族的成员，对线粒体膜电位起着调控作用，这个裂解过程发生于凋亡极早期的线粒体中［4］。此 外 还 有 证 据 表 明，Hax-1 对caspase9 有 抑 制 作用［5］。除了降解抗凋亡蛋白之外，HtrA2也可分裂前凋亡蛋白p73从而增强其作用。接受凋亡刺激后，HtrA2转移至细胞核中并分解p73，经过水解修饰的p73增强了bax基因的表达，而bax的表达产物可以刺激细胞凋之［6］。最近研究表明，HtrA2参与了内质网应激介导的细胞凋亡。衣霉素是一种内质网应激诱导物，用衣霉素处理细胞可以使线粒体中的HtrA2水平逐渐升高并释放出线粒体外，显著增加细胞凋亡比例。这些结果表明，由于内质网应激使蛋白质错误折叠导致的细胞凋亡，HtrA2是在其中起作用的［7］。HtrA2也能通过caspase非依赖性的途径导致细胞凋亡，因为HtrA2 的IAP结合基序的突变可以阻止其与IAPs的结合，但不能完全废除其促细胞凋亡的特性，这一现象的具体机制目前尚不清楚。

HtrA2在细胞的失巢凋亡中也发挥着作用。对失巢凋亡的抵抗是癌症细胞的共同特性，这有助于癌症的转移。正常细胞脱离细胞基质之后，某些成分的表达或活性发生改变，激活凋亡通路。这其中包括抗凋亡蛋白Bcl-XL 表达下调，从而引发各种前凋亡因子从线粒体转移至细胞中，这其中就包括了HtrA2。现已明确癌基因ras通过阻止HtrA2释放出线粒体外从而抑制失巢肠上皮细胞的凋亡。在这个模型中，外源性表达HtrA2 可以增加失巢细胞的凋亡倾向［8］。目前有证据表明，HtrA2参与肿瘤发生。HtrA2广泛表达于各种肿瘤细胞系，并且其表达程度具有细胞特异性。已发现在肿瘤细胞系中过表达成熟HtrA2可以诱导细胞凋亡。对活检标本的分析表明，HtrA2的表达水平在肿瘤组织和正常组织中存在差异。HtrA2蛋白水平在子宫内膜癌组织中显著降低［9］，在卵巢肿瘤中也有下降，尤其是良恶交界性卵巢肿瘤［10］。与此相反，HtrA2 在前列腺癌组织中过表达而在正常前列腺或前列腺良性增生组织中低表达或不表达。这个现象可能与前列腺癌细胞分化有关［11］。HtrA2同样在高级别胃腺癌中高表达，在经过长期雌激素处理金黄地鼠肾细胞诱发的肿瘤中，HtrA2 同样高表达［12］。HtrA2 在癌症起源中的地位尚未完全研究清楚。然而，鉴于HtrA2在调控细胞凋亡中发挥着关键作用，那么它与肿瘤发展之间的关系是显而易见的，因为肿瘤细胞之所以增殖是因为其抑制了能够引发细胞凋亡的各种机制。本次实验结果表明，HtrA2在胶质瘤中表达异常，其与肿瘤发展之间的关系需要进一步探讨。

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