舌癌原代细胞化疗药物的体外敏感性观察

白大兵 沈 军 靳敏巧 安韡 高兴明

(天津医科大学 天津 300350;①天津市口腔医院;②天津河北铁三院医院;③天津市海河医院)

△作者工作单位:天津市海河医院。

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤。由于其位置特殊，病程发展较快，淋巴结转移率较高。目前，综合治疗取得了较好的效果。但术前新辅助化疗常由于个体差异等因素的存在，导致患者对药物耐药或产生较严重的不良反应造成的治疗效果下降，甚至阻碍进一步治疗。因此，个体化化疗在临床肿瘤化疗中显得尤为重要，肿瘤药敏实验是实现肿瘤个体化化疗的基础［1］。本研究通过比较Tca83舌癌细胞株与裸鼠动物模型的原代舌癌细胞的化疗药物敏感实验，证实舌癌原代肿瘤细胞药物敏感性实验的可行性与稳定性，从而探讨实施个体化化疗。

1 对象与方法

1.1 实验对象 Tca83细胞系(北京大学口腔医院提供)。裸鼠舌癌动物模型所获的原代舌癌细胞(本课题组前期实验建立的裸鼠舌癌正位模型获得)。

1.2 主要药物及试剂 二甲基亚砜(DMSO)(美国 Sigma公司)。MTT(美国Sigma公司)。平阳霉素(天津太河制药有限公司)。紫杉醇(哈尔滨三联药业有限公司)。顺铂(云南生物谷灯盏花药业有限公司)。表阿霉素［辉瑞制药(无锡)有限公司］。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养。复苏Tca83细胞系，调节细胞密度至1×106/mL(A)。裸鼠舌癌组织块PBS冲洗并浸泡20min，减碎至大小约1mm3，置于胰蛋白酶(2mg/mL)中消化40min，200目滤网过滤，离心(1000r/min，5min)，弃上清，PBS漂洗，加入 RPMI-1640(含10%胎牛血清)调节细胞密度至1×106/mL(B)。

1.3.2 MTT法。96孔培养板内各孔分别加入A、B细胞悬液各200μl，分组后，每组4个复孔。将细胞放入37℃，5%CO2湿度培养箱中培养24h。将平阳霉素(PYM)、顺铂(CDDP)、紫杉醇(PTX)、表阿霉素按浓度梯度分为1ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、5μg/mL。每孔加入20μL药液，加入同体积 RPIM-1640培养液培养48h。弃上清，每孔加入MTT试剂15μL再培养4h。弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)微震荡5min。自动酶标读数仪上测出各孔波长570nm OD值。计算每一药物不同浓度的抑制率，公式:抑制率=(1-测试孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%

1.4 统计学处理 统计分析用SPSS 19.0统计软件处理，采用配对t检验和χ2分析，P＜0.05则表示差异有显著性。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察 加药后48h，对照组细胞处于对数生长期，细胞贴壁生长，贴壁率为90%。细胞大多为多边形，细胞连接紧密，折光性强。观察组4种药物对舌癌细胞均显示出不同程度的生长抑制作用。在抗肿瘤药物作用过程中，细胞首先出现膨胀现象，随药物浓度的提升及作用时间的增加，48h后可见50%的细胞胞体破裂、崩解、坏死等现象，其中表阿霉素效果尤为明显。

2.2 药物敏感性比较 在平阳霉素观察组中，药物浓度在50ng/mL时2种细胞均可出现变化。Tca83细胞系在药物浓度为5μ g/mL时抑制作用明显，从动物模型所取的原代细胞对药物的敏感性更高;药物浓度为25ng/mL时细胞便可出现抑制生长的变化。但高浓度药物对细胞的杀伤作用小于肿瘤细胞系。Tca83细胞系的IC50(50%细胞生长抑制时的药物浓度)为2.58μg/mL，原代细胞的IC50为4.5μg/mL。紫杉醇对肿瘤细胞系的抑制作用:药物浓度为1ng/mL时，肿瘤细胞出现明显的生长抑制，＞25ng/mL时，细胞死亡速度加快，细胞形态开始改变，胞核变大，细胞膜模糊不清，最终细胞陆续漂浮、死亡。药物对肿瘤模型中的原代细胞产生抑制作用的最小浓度为10ng/mL。细胞系的IC50为1.22μg/mL;原代细胞的IC50为 2.2μg/mL。顺铂对肿瘤细胞系产生的作用:Tca83细胞的最小抑制浓度为25ng/mL，药物浓度增大到100ng/mL时可见细胞由膨胀改为皱缩，细胞膜边界不淸，崩解加快、逐渐死亡。与肿瘤原代细胞相比，后者药物敏感性稍低。在药物浓度为5μg/mL时可见细胞大量死亡。细胞系的IC50为1.56μg/mL;原代细胞的IC50为2.4μg/mL。表阿霉素在药物浓度为25ng/mL时出现对肿瘤细胞系的抑制作用;对原代细胞抑制作用出现在浓度为100ng/mL时，细胞系的IC50为1.79μg/mL，原代细胞的IC50为3.36μg/mL。2种细胞对4种药物的敏感性顺序相同，从高到低依次为紫杉醇＞顺铂＞表阿霉素＞平阳霉素，对各类药物的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两种肿瘤细胞IC50时各药物浓度μg/mL

2.3 药物对2种肿瘤细胞的抑制程度比较 见图1，图2。

图1 Tca83细胞药敏试验结果A

图2 裸鼠舌癌原代细胞药敏试验结果B

3 讨论

舌癌作为口腔癌的常见病，在我国口腔颌面部恶性肿瘤中的发病率已达到32.3%，其中中老年患者舌癌容易出现转移。由于舌部组织血管和淋巴管丰富，使该部位恶性肿瘤增加了早期颈部淋巴管和远处淋巴管转移的可能，预后往往较差，在目前公认的术前诱导化疗+手术治疗+术后放疗的综合治疗手段中，化疗属全身性治疗，目前认为肿瘤新辅助化疗具有以下优点［2～4］:①缩小原发灶，减少切除范围，进一步保存功能或对原发灶过大而无手术指征的患者创造手术机会;②控制和消灭卫星灶和转移灶［5］;③获得肿瘤的体内药敏资料，为术后选择辅助化疗方案提供依据;④早期化疗可以防止远处转移，可提高患者的生存率和治愈率;⑤肿瘤对化疗药物的反应可作为评估病人预后的指标之一。

Kirita T［6］等的研究表明舌癌行术前辅助化疗可以降低肿瘤细胞的生存率，残余的肿瘤细胞多集中在肿块的表层，可以缩小进展性舌癌的手术范围，有利于保护其形态及功能。无论是术前诱导化疗还是术后辅助化疗，研究化疗药物对舌癌的敏感性都显得至关重要。

从本研究结果中可看出，二者对药物作用的总体趋势是相同的，同时所得结果与MTT法检测所得结果基本一致，这一现象说明Tca83细胞在体外经培养及接种成瘤后，对药物的敏感性未发生明显改变。体外敏感性检测的研究也较多。陈建文等［7］应用此法研究脑胶质瘤时发现客观有效率及疾病控制率在药敏试验敏感组显著高于耐药组。蒋芹等［8］在对食管癌的研究后，报道了联合用药者的化疗总体敏感度高于单一用药者。体外药敏试验是实现个体化化疗的有效途径之一［10］。

体外药敏试验对药物进行初步筛选和敏感度的预测，尤其是为临床患者设计合理的个体化治疗方案，避免无效药物所致的不良反应，在提高治疗效果方面具有重要的价值［9］。

在检测结果中我们发现，二者对药物的敏感性虽趋势相同，但原代细胞的IC50明显高于肿瘤细胞系。考虑原因为:①肿瘤异质性较强，即使是同一种肿瘤不同的部位对药物的敏感性也有可能不同。②MTT法实施过程中正常细胞污染肿瘤细胞，测定的0D值会受到影响，降低测定结果的稳定性。③2种癌细胞在分离过程中受机械损伤不同，修复能力下降不同［8］。

本实验通过原代细胞体外药敏试验，可以明确化疗药物对原代细胞的敏感性，对于临床选择更针对性的个体化化疗具有一定的提示作用。但是本实验仍存在问题，就是细胞培养时间是不是较长，会影响患者的最佳治疗时机的选择。这需要后续实验需要解决的问题，以期能为临床提供合适的个性化治疗。

［1］倪 炜，罗 林，左 频，等.体外药物敏感实验为依据的恶性脑胶质瘤个体化化疗初步研究［J］.现代生物医学进展，2012，12(6):1075

［2］杨 凯，季 平，李雅冬，等.时辰动脉灌注化疗在口腔鳞癌新辅助化疗中的临床应用研究［J］.临床口腔医学杂志，2006，22(1):23

［3］于吉人.胃癌新辅助化疗的研究进展［J］.实用肿瘤杂志，2010，25(5):594

［4］TADAAKI KIRITA，DDS，DMSc，et al.prognostic Value of response to preoperative chemoradiotherapy and residuaLtumor grades in tongue carcinoma［J］.OraLSurg OraLMed OraLPathoL0raLRadioLEndod，2001，91:293

［5］邱蔚六.口腔颌面外科理论与实践［M］.北京:人民卫生出版社，585-592

［6］KIRITA T，OHGI K，KAWAKAMI M，et al.Primary tumour resection of tongue carcinoma based on response to preoperative therapy［J］.Int J OraLMaxillofac Surg，2002，31(3):267

［7］陈建文，张俊平，程金建，等.体外药敏试验指导的恶性脑胶质瘤预见性化疗［J］.广东医学，2005，26(9):1183

［8］蒋 芹，匡久树，黄小明，等.MTT法体外检测癌细胞药敏试验及临床相关性研究［J］.实用癌症杂志，2001，16(1):57

［9］苏祖禄，苏 海，张 毅，等.脑胶质瘤化疗药物的体外敏感性试验研究［J］.第三军医大学学报，2013，35(13):1420

［10］毛德强，潘玲，戴勤弼，等.体外组织块培养药敏试验指导下脑胶质瘤化疗的临床疗效分析［J］.Chinese GeneralPractice，2011，14(10B):3390