汉族多发性肌炎/皮肌炎患者抗合成酶抗体谱及其临床意义

王　燕，胡　伟，郭子维，孙凌云，陈智勇

(南京医科大学附属鼓楼临床医学院，南京 210008)

抗氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-transfer RNA synthetase，ARS)抗体是多发性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)患者中最常见的一类特异性自身抗体[1]，患者常常出现发热、关节痛、雷诺现象、技工手和间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)，被称为抗合成酶抗体综合征。迄今为止共发现8种抗ARS抗体，分别针对组氨酸(Jo-1)、苏氨酸(PL-7)、丙氨酸(PL-12)、甘氨酸(EJ)、异亮氨酸(OJ)、门冬氨酸(KS)、酪氨酸(Ha)和苯丙氨酸(Zo)的氨酰基转移酶[2]，其中抗Jo-1抗体最为常见，而抗Ha及抗Zo抗体最为罕见。由于检测方法的限制，目前临床常规只能检测其中的1～2种抗体，我国人群ARS抗体谱中各抗体的阳性率尚不明确。本研究采用经典核酸免疫沉淀法对汉族PM/DM患者的抗ARS抗体谱进行检测，对抗Jo-1阳性患者与非Jo-1抗ARS抗体阳性患者的临床特点进行比较。

对象与方法

一般资料

收集2011年3月至2012年12月在南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科住院的145例PM/DM患者血清，并收集其临床资料。所有患者均符合Bohan和Peter关于PM/DM的确诊或临床诊断标准，或Sonthemier[3]和Sato等[4]关于临床无肌病型皮肌炎(clinical amyopathic dermatomyositis，CADM)的诊断标准。对于临床表现符合CADM，但因ILD致呼吸衰竭并于6个月内死亡者仍诊断为CADM。145例患者中8例合并肿瘤，但不包括合并其他结缔组织病的患者。ILD根据肺部高分辨CT诊断。所有患者均为汉族。

该研究得到南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准，全部患者均知情同意。

方法

采用核酸免疫沉淀法检测抗ARS抗体[5]。分别采用抗Jo-1、抗PL-7、抗PL-12、抗EJ、抗OJ、抗KS抗体阳性血清和正常人血清作为阳性和阴性对照。

主要步骤简述如下：(1)抗原制备：培养并回收Hela细胞，将细胞裂解液离心后取上清液作为抗原备用。(2)免疫沉淀反应：取10 μl患者血清、2 mg蛋白A-琼脂糖珠和步骤(1)所得的抗原液混合，进行免疫沉淀反应。(3)核酸提取：琼脂糖珠经酚∶氯仿∶异戊醇混合液(25∶24∶1)充分混合，加入100%乙醇待RNA析出，抽真空使所得RNA干燥。(4)核酸电泳：上述RNA中加入IPP标本缓冲液，经8%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳3 h。凝胶采用银染色试剂盒进行染色(Bio-Rad公司)，染色方法按试剂盒说明书操作。染色后对凝胶进行拍照，风干保存。所得结果同标准阳性血清电泳条带进行比对和判读(图1)。临床上通常使用酶联免疫吸附法和间接免疫荧光法对抗核抗体(anti-nuclear antibody，ANA)和抗Jo-1抗体进行检测，本研究对这2种方法和免疫沉淀法结果进行比较。采用酶联免疫吸附法检测抗黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)[6]；采用免疫沉淀-蛋白印迹法检测抗核基质蛋白2(nuclear matrix protein 2，NXP2)、抗转录中介因子1γ(transcriptional intermediary factor，TIF1γ)、抗信号识别颗粒(signal recognition particle，SRP)、抗小泛素样修饰物活化酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme，SAE)、抗Mi2抗体[7]。间接免疫荧光法检测ANA的试剂盒购自德国欧蒙公司，抗Jo-1抗体检测酶联免疫吸附法试剂盒购自深圳亚辉龙公司。

统计学处理

结　　果

汉族人群抗ARS抗体谱分布

145例PM/DM患者中，40例(27.6%)抗ARS抗体阳性。其中，抗Jo-1抗体阳性者24例(24/40，60%)，非Jo-1抗ARS阳性者16例(16/40，40%)。16例非Jo-1抗ARS阳性者中抗EJ抗体阳性者7例(7/40，17.5%)，抗OJ抗体阳性者5例(5/40，12.5%)，抗KS阳性者3例(3/40，7.5%)，抗PL-12抗体阳性者1例(1/40，2.5%)。所有抗ARS阳性患者抗PL-7、抗Ha、抗Zo、抗MDA5、抗NXP2、抗TIF1γ、抗SRP、抗SAE、抗Mi2抗体均阴性。

核酸免疫沉淀法与其他方法检测抗ARS抗体比较

在免疫沉淀法检测的抗Jo-1、抗EJ、抗OJ、抗KS和抗PL-12阳性患者中，间接免疫荧光法ANA阳性者分别为18、5、3、2和1例(共29例)，其敏感性为72.5%(29/40)。免疫沉淀法抗Jo-1阳性患者中14例酶联免疫吸附法抗Jo-1阳性，酶联免疫吸附法敏感性为58.3%(14/24)。

汉族抗ARS抗体阳性患者临床特征

抗Jo-1抗体阳性患者诊断为CADM、DM和PM者分别为0例、3例和21例，非Jo-1抗ARS抗体阳性患者诊断为CADM、DM和PM者分别为2例、7例和7例。

抗Jo-1抗体阳性和非Jo-1抗ARS阳性患者比较发现，2组患者性别和年龄分布类似。起病时发热、雷诺现象、关节痛、技工手、ILD、吞咽困难发生率在抗Jo-1抗体组(分别为54.2%、16.7%、25.0%、33.3%、91.7%和4.2%)和非Jo-1抗ARS组(分别为43.8%、31.3%、37.5%、25.0%、100.0%和18.8%)间差异无统计学意义(P>0.05)。与非 Jo-1 抗ARS阳性组(7/16，43.8%)相比，抗Jo-1阳性组(21/24，87.5%)PM患者较多，差异有统计学意义(χ2=8.75，P=0.003)。与非Jo-1合成酶抗体阳性患者相比，抗Jo-1抗体阳性患者肌酸激酶水平偏高，但差异无统计学意义[(861±820) U/Lvs.(3 041±4 351) U/L，P>0.05](表1)。

讨　　论

抗Jo-1抗体最初由日本学者发现[8]，随后抗PL-7、抗PL-12、抗OJ、抗EJ等抗体被相继发现，这些抗体的靶抗原均为氨基酰tRNA合成酶，故统称抗ARS抗体。本研究使用核酸免疫沉淀法对汉族PM/DM患者的抗ARS抗体进行检测，该方法为抗ARS抗体检测的经典方法，根据电泳所得的条带位置和组合不同可检测出所有抗合成酶抗体。虽然本研究所使用的标准阳性血清中未包含抗Ha和抗Zo抗体这2种阳性血清，但是由于未发现与所用6种标准阳性对照不同的条带组合，可确定在所测标本中不含有抗Ha和抗Zo抗体。事实上，抗Ha和抗Zo抗体尚未被其发现者以外的研究者所证实，在白种人[9]和日本人[5]的大规模研究中亦未发现这2种抗体。由此，笔者初步得出以下结论：在汉族人PM/DM患者中，抗ARS抗体总阳性率约为27.6%，其中抗Jo-1抗体最多，占全部抗ARS抗体的60%；其他抗ARS包括抗EJ、抗OJ、抗KS和抗PL-12抗体，共占全部抗ARS抗体的40%；而抗Ha和抗Zo抗体在汉族人群中可能非常罕见。Hamaguchi等[5]和Aggarwal等[9]的研究是现有文献中患者数最多且有完整抗ARS谱数据的研究，分别来自于日本人和白种人。与这些研究相比，汉族人非Jo-1抗ARS抗体占全部抗ARS抗体的比例与白种人类似(分别为40%和39.6%)，但低于日本人群(分别为40%和64.2%)。抗PL-7抗体在日本人和白种人中并不少见，分别占抗ARS的17.6%和12.4%，但本研究中未发现抗PL-7阳性患者。谢瑶等[10]曾使用免疫印迹法对31例PM/DM患者进行了检测，共发现抗Jo-1阳性患者9例(29%，9/31)，抗PL-7和抗PL-12阳性患者各1例(3%，1/31)，但由于该方法未能对所有抗ARS抗体进行检测，因而不宜与本研究结果进行直接比较。造成结果不同的原因可能是检测方法不同或患者来自于不同地区。目前已有多项研究发现，抗ARS等肌炎特异性自身抗体与人类白细胞抗原基因多态性[11]，以及某些环境因素如病毒感染、吸烟等有关[12-13]。因此，不同种族和地区人群抗ARS谱的不同可能和这些遗传因素和/或环境因素有关，但这还有待进一步研究来证实。

表1　抗Jo-1抗体与非Jo-1抗ARS抗体阳性患者临床特征比较

*与非Jo-1抗ARS阳性组比较，χ2=8.75，P=0.003

临床常用酶联免疫吸附法检测抗Jo-1抗体。在本组核酸免疫沉淀法证实的24例抗Jo-1阳性患者中，酶联免疫吸附法阳性者仅为14例，说明该方法敏感性仅为58.3%(14/24)，远不及核酸免疫沉淀法。理论上，核酸免疫沉淀法抗ARS阳性者间接免疫荧光法检测ANA亦为阳性，但由于抗原在细胞内表达水平较低或细胞固定时抗原丢失，部分抗ARS阳性血清在间接免疫荧光法检测ANA时呈阴性反应。本研究40例抗ARS阳性患者中，仅29例间接免疫荧光法ANA阳性，其敏感性为72.5%(29/40)。本结果提示，非Jo-1抗ARS抗体在汉族PM/DM患者中并不少见，在临床表现呈典型抗合成酶抗体综合征的患者，在酶联免疫吸附法检测抗Jo-1抗体阴性和(或)间接免疫荧光法ANA阴性情况下，仍需积极考虑抗合成酶抗体综合征的诊断。

在本研究中，抗Jo-1抗体阳性患者和非Jo-1抗ARS抗体阳性患者在性别、年龄和发热、雷诺现象、关节痛、技工手、ILD、吞咽困难等发生率和CK水平方面差异均无统计学意义。虽然抗ARS抗体阳性患者一般具有上述共同表现，但也有研究认为不同抗ARS抗体可能对应不同临床特征。例如，Labirua-Iturburu等[14]对18例欧洲抗PL-7阳性患者的研究发现，除上述表现外，该抗体还可能和心包炎有关；Yamasaki等[15]对日本患者的分析发现，与抗Jo-1抗体阳性患者相比，抗PL-7患者的肌肉受累较轻；Hamaguchi等[5]发现，抗KS和抗OJ患者起病时大多只有间质性肺炎，随病情进展逐渐出现肌炎表现。最近，Aggarwal等[9]通过大规模人群研究发现，非Jo-1合成酶抗体阳性患者的生存时间显著低于抗Jo-1抗体阳性患者。非Jo-1抗ARS抗体临床常常难以检测，因此，非Jo-1合成酶抗体阳性患者即使伴有ILD，但由于无抗体结果支持，临床仍难以明确诊断其为抗ARS综合征，从而导致诊断和治疗延迟，笔者认为这种延迟可能是患者生存时间缩短的原因之一[9]。汉族患者是否也具有以上这些特征，还需进一步扩大标本量进行研究。国外部分资料显示，抗Jo-1阳性患者以DM多见[5，16]，而本研究患者中抗Jo-1阳性患者多数并无DM特异性皮疹[向阳疹和(或)Gottron疹/征]，因而诊断为PM。部分患者虽然有技工手、披肩征或V形征等皮肤表现，但根据Bohan和Peter的标准，此类患者仍被诊断为PM。Doblouq等[16]开展研究为基于人群的调查性研究，Hamaguchi等[5]研究中的患者来自风湿科、皮肤科和呼吸科等多个学科；而本研究患者均来自于风湿免疫科，患者来源不同导致DM特异性皮疹患者比例不同，可能是造成这种差异的主要原因(就诊于皮肤科的患者皮疹比例可能更大)。

本研究的不足之处：样本量相对较小，随访时间相对较短且部分患者失访，未能对各抗ARS抗体临床特点及结局等进行详细比较；患者均来自江苏地区，尚不足以代表全部汉族人群，因而应对结果进行谨慎解释等。

综上所述，本研究首次对汉族PM/DM的抗ARS谱进行了全面检测，结果显示非Jo-1抗ARS抗体在汉族PM/DM患者中并不少见，其临床表现与抗Jo-1阳性患者类似，对临床表现符合抗合成酶抗体综合征但常规检测抗Jo-1抗体阴性患者，应考虑到非Jo-1抗ARS抗体阳性的可能。

致谢：抗Jo-1、抗PL-7、抗PL-12、抗EJ、抗OJ、抗KS抗体阳性血清由日本庆应大学医学院附属医院风湿科Kuwana教授提供。

图1核酸免疫沉淀法检测抗合成酶抗体

Fig1Anti-synthetase antibodies detected by RNA-immunoprecipitation

1～6分别为抗PL-12、抗OJ、抗EJ、抗KS、抗PL-7和抗Jo-1抗体阳性标准血清；8：抗KS；15：抗OJ；38：抗Jo-1；47：抗EJ；49：阴性；57：抗EJ；83：抗PL-12；95、100：抗EJ；*6、57和95同时伴有抗SSA抗体阳性

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