HPLC法测定家兔血浆中士的宁的浓度

赵引利 何燕宁 杨冬丽 张东阁 杨宇杰 王春民

1.承德医学院中药研究所中药实验中心，河北 承德 067000；2.承德颈复康药业集团有限公司药物研究院制剂研究中心，河北 承德 067000；3.河北省中药新辅料工程技术研究中心药物制剂研究中心，河北 承德 067000

中药马钱子为马钱科植物马钱 （Strychnos nux-vom ica）或云南马钱（Strychnos pierriana）的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿等功效[1]。士的宁既是马钱子的主要有效成分又是有毒成分，占马钱子总生物碱的50%左右[2]。2010版《中国药典》所收录的含马钱子的中成药多以片剂、丸剂、胶囊剂等口服用药为主，且马钱子在中成药中均为君药、臣药，表明马钱子治疗作用突出[3]。但目前以马钱子粉或含马钱子中成药入药的药动学研究均为大鼠灌胃[4-7]，既难以进行临床用药剂型研究，又难以实现同一动物多次取血，较难体现药物在同一个体内的药动学真实情况，而家兔灌胃含马钱子中成药的药动学相关研究尚未见报道。本实验采用单因素考察，确定含药血浆处理方法；建立高效液相色谱（HPLC）法测定家兔血浆中士的宁的浓度。以期对含马钱子中成药口服类用药的药动学研究提供方法借鉴，以指导临床安全用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），G1329B自动进样器，G1314FVWD检测器；TDL-40B型离心机 （上海安亭科学仪器厂）；TG16-WS台式高速离心机（长沙湘仪离心机有限公司）；MX-S可调式混匀仪（北京大龙兴创实验仪器有限公司）；AL104型电子天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；AE240型电子天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-700DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDA-8002型水浴锅（余姚明伟仪表厂）。

1.1.2 药品与材料 士的宁对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，按97.1%计；批号：110705-201307）；庚烷磺酸钠（色谱纯，天津市光复精细化工研究所；批号：20140305）；腰痛宁胶囊（颈复康药业集团有限公司；批号：491044）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。实验用血浆取自新西兰兔[许可证号：SCXK（京）2014-0003]。

1.2 色谱条件

色谱柱为Agilent 5 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Agilent TC-C18预柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合（用10%磷酸调pH至3.0）-乙腈（0.5∶79.5∶20.0）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃。

1.3 标准储备液的配制

精密称取士的宁对照品适量置10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成浓度为0.8292 mg/mL的士的宁储备液，4℃冷藏备用。

1.4 标准溶液的配制

精密吸取士的宁储备液适量，用流动相稀释，得到质量浓度为 0.22、0.37、0.75、1.49、4.15、7.46、14.93 μg/mL的士的宁系列标准溶液，4℃冷藏备用。

分别将 0.37、4.15、14.93 μg/mL 士的宁标准溶液用流动相稀释5倍，所得溶液，分别标记为士的宁标准溶液 a、b、c，4℃冷藏备用。

1.5 血浆样品处理

1.5.1 碱液种类及浓度考察 精密吸取家兔空白血浆1.5 mL置50 mL尖底离心管中，加入4.15 μg/mL士的宁流动相溶液20 μL，涡旋30 s，配制成一定浓度的含药血浆；加异丙醇-甲醇（4∶1）混合溶剂0.5 mL，分别考察加入 0.5 mL氨水，0.5 mL的 1、2、3 mol/L NaOH溶液，涡旋30 s，冷水中超声15 min，加入正己烷-二氯甲烷-异丙醇（60∶35∶5）4 mL，涡旋 1 min，3000 r/min离心10 min，收集下层液，于37℃水浴氮气吹干，用 100 μL 流动相复溶，涡旋 1 min，12000 r/min离心15 min，得供试品溶液，进样70 μL测定[8-10]。另取士的宁标准溶液b，直接进样70 μL测定峰面积。将供试品溶液所得士的宁峰面积与对照品流动相溶液的峰面积比较，计算士的宁绝对回收率，结果分别为32.53%、20.04%、32.41%、32.75%。由结果可得2 mol/L NaOH溶液与3 mol/L NaOH溶液、氨水的绝对回收率差别不大，但氨水挥发性强，综合考虑选择2 mol/L NaOH溶液。

1.5.2 萃取次数的考察 考察碱液为2 mol/L NaOH溶液时，萃取次数分别为1次和2次时士的宁的绝对回收率。萃取1次方法同“1.5.1”项下方法；萃取2次方法同“1.5.1”项下方法，重复萃取过程2次，合并2次下层液，于37℃水浴氮气吹干，用100 μL流动相复溶，涡旋1 min，12000 r/min离心15 min，得供试品溶液，进样70 μL测定。士的宁绝对回收率结果分别为32.41%和62.34%，表明萃取2次结果更佳。

1.5.3 萃取剂种类的考察 考察碱液为2 mol/L NaOH溶液，萃取次数为2次，分别以氯仿、二氯甲烷、氯仿-甲醇（9∶1）、二氯甲烷-甲醇（9∶1）、正己烷-二氯甲烷-异丙醇（60∶35∶5）作萃取剂时士的宁的绝对回收率[10-12]。同“1.5.2”项下方法萃取2次，结果分别为59.92%、73.54%、53.82%、74.97%、62.34%。根据结果可得二氯甲烷和二氯甲烷-甲醇（9∶1）所提士的宁的绝对回收率较为理想，但二氯甲烷萃取后样品杂质较少，同时考虑操作从易的原则，选择二氯甲烷作为萃取剂。

1.5.4 萃取剂加入量的考察 考察碱液为2 mol/L NaOH溶液，萃取次数为2次，萃取剂二氯甲烷每次加入量为 3、4、5、6 mL 时士的宁的绝对回收率[13-14]。同“1.5.2”项下方法萃取2次，结果分别为67.94%、69.30%、79.28%、70.95%。由结果可得加入量为5 mL时，士的宁的绝对回收率较理想，故选择每次加入量为5 mL。

继续考察萃取剂为二氯甲烷，第1次加入量为5mL，第2次加入量分别为3、4、5 mL时士的宁的绝对回收率。方法同上，结果分别为69.58%、80.10%、79.28%。由结果可知，第2次加入量为4 mL和5 mL时结果均较理想，从节约资源的角度考虑，选择第2次加入4 mL。

1.5.5 加萃取剂后涡旋时间考察 考察碱液为2 mol/L NaOH溶液，萃取次数为2次，萃取剂为二氯甲烷，第1 次 5 mL，第 2 次 4 mL，涡旋时间分别 1、3、5 min 时士的宁的绝对回收率[15]。同“1.5.2”项下方法萃取2次，结果分别为81.78%、77.77%、77.63%。根据结果，涡旋3 min和5 min易产生乳化，使回收率降低，故选择涡旋1 min。

1.5.6 破膜剂种类考察 考察碱液为2 mol/L NaOH溶液，萃取次数为2次，二氯甲烷萃取涡旋1 min，第1次5 mL，第 2 次 4 mL，破膜剂分别为异丙醇-甲醇（4∶1）、异丙醇-甲醇（1∶1）和乙腈时士的宁的绝对回收率[8，16]。同“1.5.2”项下方法萃取2次，结果分别为81.78%、68.03%、85.22%。结果表明，乙腈做破膜剂较为理想。

1.5.7 血浆样品处理方法 综合以上筛选，确定血浆样品处理方法为：精密吸取含药血浆1.5 mL置50 mL尖底离心管中，加乙腈和2 mol/L NaOH溶液各0.5 mL，涡旋30 s，置冷水中超声15 min，再加二氯甲烷5 mL，涡旋1 min，3000 r/min离心10 min，收集下层液；剩余血浆再加二氯甲烷4 mL，涡旋1 min，3000 r/min离心10 min，收集下层液；合并2次下层液，于37℃水浴氮气吹干，用100 μL流动相复溶，涡旋1 min，12 000 r/min离心15 min，得供试品溶液，进样70 μL测定。

2 结果

2.1 方法专属性

将“家兔空白血浆+士的宁对照”样品、家兔灌胃腰痛宁胶囊后的含药血样、家兔空白血浆，按“1.5.7”项下方法操作，考察方法专属性。见图1。

2.2 线性关系试验

精密吸取7份家兔空白血浆各1.5 mL，分别加入士的宁对照品系列标准溶液20 μL，涡旋30 s，配制成相当于士的宁浓度为 2.99、4.98、9.95、19.90、55.28、99.51、199.02 ng/mL 的系列标准样品，再按“1.5.7”项下方法操作。以士的宁血浆浓度C（ng/mL）为横坐标X，峰面积A为纵坐标Y，建立标准曲线；用加权（1/C2）最小二乘法进行线性回归运算；以S/N=10测定最低定量限。得线性回归方程为：Y=1.386 X+1.022，r=0.9985，线性范围为：2.99～199.02 ng/mL，最低定量限为 0.10 ng。

2.3 回收率试验

同“2.2”项下方法配制低、中、高 3个浓度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）质控血浆样品各 5 份，按“1.5.7”项下方法操作，同时绘制随行标准曲线，记录士的宁峰面积AT，计算质控血浆样品中士的宁浓度，用实测浓度平均值与理论浓度比较，求得方法回收率；另取士的宁标准溶液 a、b、c各 5份， 直接进样 70 μL，记录士的宁峰面积AS，用AT平均值与AS平均值比较，求得绝对回收率，结果表明士的宁的绝对回收率均＞70%，方法回收率：低浓度在80%～120%，中、高浓度在85%～115%，均符合要求。见表1。

2.4 精密度试验

精密吸取家兔空白血浆1.5 mL，加入流动相配制的士的宁系列浓度对照品溶液20 μL，涡旋30 s，配制成低、中、高 3 个浓度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）的质控血浆样品，每个浓度5份样品，按“1.5.7”项下方法操作，于1 d内每个浓度每份样品测定1次，同时绘制随行标准曲线，记录士的宁峰面积，计算质控样品中士的宁浓度，求得3个浓度的日内精密度；连续测定5 d，每天每个浓度1个样品，每个样品测定1次，每天绘制1条随行标准曲线，记录士的宁峰面积，计算质控样品中士的宁浓度，求得3个浓度的日间精密度，结果表明低浓度日内、日间精密度均＜20%，中、高浓度均＜15%，结果均良好。见表2。

2.5 稳定性试验

考察 3 个浓度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）质控样品在室温放置 0、4、8、12、24 h 的稳定性；-20℃及室温冻融循环 0～3 次的稳定性；-20℃保存 0、5、10、15、20 d的稳定性。结果3个浓度样品峰面积的平均值与0 h或0次测定值的偏差绝对值均在5%以内，表明质控样品室温放置24 h内和冻融循环3次以内稳定性良好；15 d和20 d样品中士的宁发生了分解，0、5、10 d所得数据计算偏差绝对值，结果均在5%以内，证明样品在10 d内稳定性良好。

3 个浓度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）质控样品，按“1.5.7”项下方法操作得到供试品溶液，考察室温放置0、4、8、12、24 h的稳定性。结果3个浓度质控样品峰面积测定值的平均值与0 h测定值的偏差绝对值均在5%以内，表明血样处理后室温放置24 h内稳定性良好。

3 讨论

图1 家兔血浆中士的宁的高效液相色谱图

目前对含马钱子的中成药或马钱子粉的药动学研究均为大鼠灌胃[4-7]，难以对同一动物多个时间点取血，因存在个体差异性，无法体现药物在同一个体内药动学的真实情况；而家兔灌胃可以实现多点采血，解决了这一问题。故本实验建立了测定家兔血浆中士的宁的检测方法。本实验曾试过Phenomenex C18柱、Kromasil C18柱、Inertsil ODS-3柱等，但有拖尾、峰展宽或分离困难等现象，最终确定为Agilent TC-C18柱，峰分离良好，无拖尾和峰展宽情况，理论塔板数符合要求[17-18]。在实验初期，发现士的宁甲醇溶液进液相检测不成线性，而改为士的宁流动相溶液则成线性，可能是由本实验流动相的水相比例偏大造成的，故最终选择用流动相稀释和样品定容。样品处理过程中发现，加入萃取剂后超声与否对绝对回收率无影响，说明加碱液已经使士的宁游离，可直接萃取；氮气吹干时水浴温度为50℃时绝对回收率降低，可能高温使一些内源性物质对士的宁产生降解或与之结合，故最终选择37℃[19-20]。另外，含药血浆在-20℃储存15 d和20 d，发现峰面积开始减小，且士的宁峰附近出现异常峰，20 d色谱图最为明显，士的宁峰与异常峰的峰面积之和与0 d士的宁峰面积接近，怀疑士的宁在血浆内源性物质的作用下发生了降解，故血样-20℃存储不宜超过10 d。本实验所得家兔血浆中士的宁的处理方法和检测方法可靠，有望应用到家兔灌胃含马钱子的中成药后士的宁的药动学研究中。

表1 士的宁的绝对回收率与方法回收率（n=5）

表2 士的宁的日内、日间精密度（n=5）

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