HIF-1α对乳腺癌并发2型糖尿病患者微血管生成的影响

宋秋艳 董瑞鸿

郑州大学第五附属医院内分泌科，河南 郑州 450000

缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧条件下肿瘤细胞产生的一种核转录因子，调节细胞适应低氧状态下的能量代谢和氧的运输，是体内维持细胞内氧平衡的主要调控因子[1]。HIF-1α在各类癌组织血管生成方面的研究是目前临床上的热点[2]，但是其与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、微血管密度（microvessel density，MVD）的关系研究在国内还比较少见。本研究旨在探讨HIF-1α在合并糖尿病乳腺癌组织中的表达及其与VEGF和MVD，来研究HIF-1α在乳腺癌组织生长、癌细胞增殖和转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年6月～2015年6月在郑州大学第五附属医院接受手术切除治疗的乳腺癌合并2型糖尿病的女性患者的乳腺标本蜡块79例（观察组）和非糖尿病的乳腺癌患者乳腺标本蜡块95例（对照组）。两组患者均为女性，观察组年龄28～71岁，平均（48.5±9.2）岁，对照组年龄 31～74 岁，平均（47.1±8.8）岁。两组患者性别和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者在术前均未接受过放化疗的治疗，全部病例类型均为浸润癌。患者被明显确认为乳腺癌患者。诊断标准：通过影像学检查、组织病理学和细胞病理学检查，并经过两名权威乳腺癌诊治专家进行鉴别得到确诊的乳腺癌患者[3]。

1.2 试剂与仪器

HIF-1α单抗浓缩液、VEGF单抗浓缩液均购自武汉博士德生物科技有限公司；CD34单抗工作液、SP试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）染色剂、HE染色剂均购自福州迈新生物科技有限公司。

1.3 检测方法

乳腺癌患者石蜡包埋标本共174例，每例蜡块间断连续切取4 μm切片5张，选取1张进行常规的HE染色，其他切片进行HIF-1α、VEGF、MVD免疫组化染色。免疫组化染色采用SP法，严格按照说明书进行操作，具体步骤如下：①烤片，68℃，20 min。②常规二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min），梯度酒精脱水（100%乙醇Ⅰ10 min，100%乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min。③阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min。④抗原修复：置0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中用煮沸（95℃，15～20 min），自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min。⑤正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗。⑥滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min。⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育 30 min，PBS 冲洗 3×5 min。⑧DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片[4-5]。

1.4 结果判定

以武汉博士德生物科技有限公司和福州迈新生物科技有限公司提供的阳性切片为标准，在高倍光镜下HIF-1α以细胞核或核浆内有棕黄色颗粒或被染色成棕黄色为阳性判定标准[6]。高倍镜下（400）每张切片随机选取5个视野，每个视野计数150个细胞，共计750个，计算阳性细胞率，≤15%为阴性，＞15%为阳性。VEGF以细胞核或核浆内呈棕黄色为阳性细胞，＞10%为阳性，≤10%为阴性。MVD：低倍光镜下选取血管分布最为密集的区域，400倍光镜视野下随机计数5个视野，CD34呈棕黄色为阳性，计数5个视野中的血管数的平均值构成MVD，要排除有炎症、肉芽或坏死的血管[7]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson相关性分析研究各指标间的关系；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组临床病理特征的对比

通过数据分析，在淋巴结转移方面，观察组的转移率为65.8%（52/79），对照组的转移率为35.8%（34/95），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。在年龄、月经情况和雌、孕激素受体状况方面差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。见表 1。

2.2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌组织中的表达及MVD计数

通过视镜的观察，HIF-1α的表达主要体现在浸润肿瘤细胞的细胞核，观察组阳性表达率高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；观察组VEGF的阳性表达及MVD计数均高于对照组，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1 两组患者临床病理特征分析

表2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌组织中的表达及MVD计数

2.3 乳腺癌组织中HIF-1α的表达及其与 VEGF、微血管密度MVD的关系

观察组HIF-1α阳性表达的71例组织中，65例VEGF阳性表达；HIF-1α阴性表达的8例组织中，6例VEGF阳性表达，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。对照组HIF-1α阳性表达的69例组织中，56例VEGF阳性表达；HIF-1α阴性表达的26例组织中，21例VEGF阳性表达，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。观察组组织中HIF-1α阳性者的MVD计数明显多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。Pearson相关性分析发现，HIF-1α与VEGF及MVD均呈正相关（r=0.695，P ＜ 0.01；r=0.680，P ＜ 0.05）。

表3 乳腺癌组织中HIF-1α的表达与VEGF的相关性[n（%）]

表4 两组患者不同HIF-1α表达情况MVD计数比较（）

表4 两组患者不同HIF-1α表达情况MVD计数比较（）

注：HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；MVD：微血管密度

组别 例数 HIF-1α阳性HIF-1α阴性 t值 P值观察组对照组79 95 121.2±31.8 111.4±31.6 102.5±33.2 103.5±27.3 2.204 1.202 0.030 0.232

3 讨论

既往的研究表明，合并糖尿病的乳腺癌患者的乳腺癌的分化程度比较低，预后也比较差[8-10]。在本研究中，HIF-1α和VEGF的阳性表达主要存在于乳腺癌细胞的细胞核内或是细胞核浆内，在浸润癌细胞边缘的表达相对较弱，这可以作为乳腺癌早期浸润阶段的生物学指标，提示不良的预后[11]。

血管的成长在各种组织的修复或恶化，炎症和肿瘤的加重或增生、转移过程中都有比较重要的作用[12-14]。特别是合并糖尿病、高血压等并发症的肿瘤患者的癌变组织需要通过新生的微血管来补充必要的养分来维持正常的生理代谢，为进一步的细胞增殖和转移提供动力。在国内外已经有大量的研究表明，HIF-1α和VEGF是肿瘤诱导产生新血管的主要细胞因子，且HIF-1α的阳性表达是通过VEGF的阳性表达来实现的，可见VEGF在肿瘤新血管生成方面的作用比较强[15-17]。HIF-1α是在缺氧条件下存在于人体内的一种异源二聚体，既是氧调节亚基也是一种活性基，它可以和VEGF的结合位点相结合，促进癌变组织的新血管形成，维持癌细胞的正常代谢功能并能促进癌细胞的增殖和转移[18-20]。在本研究中，通过数据的对比分析发现，合并2型糖尿病的乳腺癌患者HIF-1α的阳性表达率为89.9%（71/79），对照组患者为 72.6%（69/95）。这就表明，影响合并2型糖尿病的乳腺癌患者预后的重要因子就是HIF-1α。与此同时，本研究也检测了两组患者乳腺癌组织中MVD数量，结果显示观察组的MVD数量明显高于对照组。这些都表明合并2型糖尿病的乳腺癌患者预后较差，与HIF-1α和VEGF的表达和MVD数量有直接的关系。本研究通过Pearson相关分析显示，HIF-1α和 VEGF呈正相关（r=0.695，P ＜ 0.01），与 MVD 也呈正相关（r=0.680，P ＜ 0.05）。

综上所述，通过研究合并2型糖尿病的乳腺癌组织中HIF-1α的表达及其与VEGF、MVD的关系，发现合并2型糖尿病可能会影响乳腺癌患者的病情甚至造成癌变组织的增生和转移，使预后变差。这也为糖尿病与乳腺癌之间的关系提供了有力的依据。

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