精子端粒长度与特发性男性不育相关

刘舒媛，张昌军，彭海英，黄小琴，孙浩，林克勤，黄铠，褚嘉祐，杨昭庆

1. 中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所，昆明 650118；

2. 湖北省十堰市人民医院生殖医学研究中心，十堰 442000

精子端粒长度与特发性男性不育相关

刘舒媛1，张昌军2，彭海英2，黄小琴1，孙浩1，林克勤1，黄铠1，褚嘉祐1，杨昭庆1

1. 中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所，昆明 650118；

2. 湖北省十堰市人民医院生殖医学研究中心，十堰 442000

端粒是真核生物染色体末端的多功能特异性DNA-蛋白结构，覆盖在染色体末端，保护基因组的稳定性。端粒在减数分裂过程中起到了十分重要的作用，协助染色体配对、联会、同源重组和分离。精子中的端粒可能在精子的受精能力和胚胎发育中起到重要作用。近年来，端粒与生殖的相关性研究成为一个新的热点，但精子端粒与男性不育间的相关性并不明确。本文采用实时荧光定量PCR方法检测中国特发性男性不育人群（126例）和正常可育男性人群（138例）的精子相对端粒长度，结果发现，特发性男性不育病例的精子平均相对端粒长度（2.894±0.115）低于正常对照组（4.016±0.603），差异具有统计学意义（P=5.097×10-5）；并且精子相对端粒长度与精子密度、精子总数和精子活力都有显著的相关性：精子数量较多和/或精子活力较高，精子相对端粒长度较长。研究结果提示，在中国人群中，精子端粒长度与特发性男性不育具有相关性，精子的端粒长度可能影响精子发生和精子的功能，精子端粒的缩短导致精子数目及活力的降低从而导致男性不育。

端粒长度；特发性男性不育；精子数目；精子活力

全世界已婚孕龄夫妇存在生育困难的比率高达10%～15%，男女因素各占一半。男性精子发生是一个极为复杂的过程，常染色体或者性染色体上的基因突变均有可能影响精子发生过程，从而导致男性不育［1，2］。目前仍有一些应用现有手段不能找出病因的不育，很大一部分男性不育症患者除精子异常外均正常，且精子异常原因不明，故称为特发性男性不育症，约占男性不育症的20%～30%［3］，包括特发性寡精症（Oligozoospermia）、无精子症（Azoospermia）、弱精子症（Asthenzoospermia）和畸形精子症（Teratozoospermia）4类。

端粒是真核生物染色体末端的多功能特异性DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列富含G的高度保守重复序列（如人的重复序列为TTAGGG），端粒的长度和端粒结构都对端粒自身功能有十分重要的作用。端粒覆盖在染色体末端，保护基因组的稳定性。端粒在减数分裂过程中，协助染色体配对、联会、同源重组和分离。在每次细胞分裂过程中，端粒长度将程序性的缩短。这些核蛋白重复序列在精子中位于细胞核外围并与组蛋白相结合，对氧化损伤极为敏感。

研究发现，精子中的端粒在小鼠的生殖能力和胚胎发育中具有重要的作用，端粒缩短与小鼠精子DNA损伤以及人类胚胎发育异常有关［4］。小鼠精子的染色体具有足够长度的端粒才能正常的受精，敲除端粒酶的小鼠由于缺乏端粒酶维持端粒的长度，精子受精能力受损，并且无论是精子或是卵子的端粒缩短，都将造成受精卵的异常分裂和生长［5］。如果人胚胎中的端粒很短，会导致细胞质片段化，生成形态异常的胚泡然后凋亡［6］。端粒的长度依靠端粒酶来维持，端粒酶在生殖细胞中高表达，这可能是随着年龄的增加端粒在精子细胞中的长度长于体细胞的原因（人体细胞中端粒约5～10 kb，而生殖细胞中的端粒约10～20 kb）［7］。端粒酶活性降低和端粒长度缩短会导致细胞凋亡以及精子数量和受精能力降低［7］。

目前已发现许多疾病（如癌症）与端粒长度缩短有关［8］。研究发现，男性不育患者精子的平均相对端粒长度（0.674±0.028）显著低于正常对照精子的平均相对端粒长度（0.699±0.030，P＜0.005）［9］，精子端粒长度与精子总数具有相关性，寡精子症的精子平均端粒长度（0.95±0.22）显著低于正常精子的平均端粒长度（1.24±0.25，P＜0.0001），且后代精子的端粒长度与父母生育时的年龄有极大的相关性［10］。本文旨在分析精子端粒长度在特发性男性不育人群和正常可育男性人群中的差异以及端粒长度与精液常规参数间的相关性，揭示端粒长度与特发性男性不育的相关性。

1　对象与方法

1.1研究对象

选取2008～2010年间在湖北省某医院就诊的特发性男性不育患者126例，年龄23～57岁，有3～5年不育病史，其配偶妇产科检查正常。精液常规检查参考2010年《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）相关规定进行，正常精液标准为：精液体积≥1.5 mL，精子密度≥15×106个/mL，精子总数≥39×106个，精子活力a+b≥32%，精子活动率≥58%，正常形态率≥4%，白细胞数＜1.0×106个/mL。患者按照精液分析结果分层为：寡精症（精子密度＜15×106/ mL或者精子总数＜40×106个，精子活力a+b≥32%）、寡弱精症（精子密度＜15×106/mL或者精子总数＜40×106个，精子活力a+b＜32%）及弱精症（精子密度≥15×106/mL或者精子总数≥40×106个，精子活力a+b＜32%）。选取同期在该院就诊的健康已育男性138例作为正常对照，年龄22～52岁，精液常规检查正常，精子密度≥15×106/mL，活动力a+b≥32%。根据知情同意原则，分别收集病例和对照的精液样本。

1.2精液样本的收集和检测

所有研究对象都经过男科学基本检查，包括精液常规检测、体格检查、激素检查、既往疾病史问询、以及核型分析、Y-染色体微缺失检测。精液常规检测参照2010年《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）［11］。精液样本均在禁欲3～5天后，手淫法留取，收集精液标本后置于50 mL洁净烧杯中，37℃恒温水浴箱内30分钟内液化待检。

液化精液经Tris·HCl（pH6.8）洗涤后，置于-80℃冻存，临用前取出。

1.3精子全基因组DNA提取

收集精液样本，用酚-氯仿法提取精子全基因组DNA，紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳分别进行DNA定量和定性检测。

1.4实时荧光定量PCR方法测定精子基因组端粒长度

根据文献［12，13］，采用实时荧光定量PCR方法测定基因组的端粒长度。运用样本DNA端粒拷贝数（T）与单拷贝数内参基因36B4拷贝数（S）的比值，即相对端粒长度（T/S比值）来评估各检测样本的端粒长度。实时定量PCR反应采用标准曲线法，将细胞系HEK293T的基因组DNA进行倍比稀释成：100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL和0.01 ng/μL作为标准品。标准品和样本基因组DNA（20 ng），均做3个平行复孔，使用BIO-RAD CFX-96荧光定量PCR仪（Hercules，CA，USA）进行扩增，扩增体系总体积20 μL，PCR反应体系如下：SYBR Green Master（北京康维生物），样本DNA，引物5 pmol。端粒DNA的扩增引物为：TelF 5'-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3'，TelR 5'-TCCCGACTATCCCTATCCCTTCCCTATCCCTATCCCTA-3'；内参单拷贝基因36B4的扩增引物：36B4F 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'，36B4R 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'，引物由Invitrogen公司合成。定量PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃15 s，56℃ 1 min，40个循环，65～95℃熔解曲线5 s。

用BIO-RAD CFX Manager 3.1直接获得样本端粒DNA和内参基因的CT值。

1.5统计分析

特发性男性不育病例和正常对照间的相对端粒长度差异用Student's t 检验，精子相对端粒长度与精液常规参数间的相关性用Pearson相关（Pearson correlation，rp）检验。数据统计分析用SPSS17.0 （SPSS Inc.， Chicago， IL， USA）软件进行。

2　结果与分析

2.1病例和对照组间各项参数的比较

比较病例组和对照组患者的年龄、不育年限、禁欲时间以及精液常规参数（精液体积、精子密度、总精子数、精子活力和精子正常形态率）间的差异，发现精子密度、总精子数和精子活力在病例组和正常对照组间的差异具有统计学意义（P＜0.001或P＜0.05），其他参数在病例组和对照组间无差异（表1）。

表1　病例和对照间参数的比较

2.2病例和对照间精子平均相对端粒长度差异

特发性男性不育病例组（126例）的精子平均相对端粒长度（T/S）（2.894±0.115）低于正常对照组（138例）（4.016±1.603），差异具有统计学意义（P=6.744× 10-10）。将特发性男性不育病例进行分层，各亚层分别与对照组进行比较，发现弱精症和寡弱精症患者的精子平均相对端粒长度（T/S）（3.022±0.119和2.088±0.717）均显著低于正常对照组（4.016±1.603），差异具有统计学意义（P=1.030×10-6和P=1.072× 10-6），寡精症的精子平均相对端粒长度（T/S）（3.136± 0.885）也低于正常对照的精子平均相对端粒长度（4.016±1.603，P=0.042）（图1）。

图1　精子平均相对端粒长度（T/S）在特发性男性不育病例组与正常对照组间的比较

2.3相对端粒长度与精液参数间的相关性

精子相对端粒长度（T/S）与男性年龄、精子密度、精子总数、精子活力间的相关性用pearson相关（Pearson correlation，rp）进行统计分析，发现精子相对端粒长度（T/S）与精子密度、精子总数和精子活力都有显著的相关性，精子数量较多，精子相对端粒长度较长；精子活力较高，精子相对端粒长度较长（表2，图2）。

3　讨　论

端粒对于保持基因组的稳定性和完整性具有重要的作用，目前发现许多疾病都与端粒长度缩短有关联。近年来端粒与生殖间的关联性受到关注，端粒异常可能会导致生育障碍［14］。通常精子中的端粒很长（10～20 kb），而体细胞中的端粒长5～10 kb［7］，并且端粒的长度可以遗传到后代中。端粒的长度依靠端粒酶来维持，端粒酶在生殖细胞中高表达。端粒酶缺失的精子（TR-/-）与正常卵子受精后，胚囊难以形成，胚胎分裂受阻甚至凋亡［5］。Ferlin等［15］提出，精子端粒长度可作为研究精子发生和男性不育的一个新标记，精子携带较短的端粒可视为是精子发生（Spermatogenesis）障碍的一个标志［10］。Thilagavathi等［9］首先发现男性不育患者精子端粒长度显著低于正常男性精子；Ferlin等［10］在18～19岁的男性中进行的研究发现，精子端粒长度与精子数目有相关性，寡精子症的精子端粒长度显著低于正常精子的端粒长度，并且后代精子的端粒长度与父母生育时的年龄显著相关［10］。本研究的结果显示，中国人群中特发性男性不育病例（寡弱精症、寡精症、弱精症患者）的精子平均相对端粒长度显著低于正常可育男性的精子平均相对端粒长度；并且精子相对端粒长度与精液精子总数和精子密度有显著的相关性。本研究结果提示，端粒可能在精子发生过程中起到重要作用。由于联会复合物配对紊乱将导致精子发生失败［16］，而端粒在减数分裂过程中是协助染色体配对、联会、同源重组和分离的重要元件，精子端粒的缩短可能导致精子减数分裂过程中联会分离错误，从而导致精子发生受阻；或者端粒功能异常导致生殖细胞凋亡，最终导致精子数量降低。

表2　精子相对端粒长度（T/S）与精液参数间的相关性

图2　精子密度、精子总数和精子活力与精子相对端粒长度（T/S）的相关性

值得注意的是，本文研究发现，精子相对端粒长度的缩短与精子活力降低有相关性，这在以往的研究并未见类似的结果。端粒在维持精子基因组稳定性和完整性中起到了十分重要的作用，精子携带较短端粒，其DNA断裂的比例升高［17］。精子核基因组的完整性对维持精子正常功能有重要作用，具有DNA损伤的精子势必在结构、精子活力和受精能力等方面有缺陷，最终导致不孕不育、胚胎发育异常、流产、死产和子代疾病以及影响辅助生殖结局。精子DNA损伤与精子密度、活力和精子正常形态率具有相关性［18］。精子端粒定位于精子细胞核外围，与组蛋白相结合，保护精子基因组的完整性和稳定性。精子端粒的损伤更加剧了精子DNA损伤。Thilagavathi等［9］对男性不育人群和正常人群中端粒长度与精子DNA片段化和精子ROS水平进行检测，但未发现ROS水平、精子DNA片段化与精子端粒长度间的相关性。本研究发现，精子相对端粒长度缩短与精子活力降低有相关性，这提示精子端粒缩短与精子DNA损伤可能存在相关性，精子端粒缩短可能会造成精子DNA损伤，从而造成精子活力降低和功能下降。但这一推测还需进一步深入研究。

综上所述，本研究表明，在中国人群中精子端粒长度与特发性男性不育具有相关性：特发性男性不育患者精子端粒长度显著低于正常男性精子，并且精子端粒的长度缩短与精子数量减少和精子活力降低具有相关性，即精子的端粒长度可能影响精子发生和精子的功能，精子端粒的缩短导致精子数目及活力的降低从而导致男性不育。同时，精子发生是一个复杂的过程，受到遗传因素和环境因素的复杂调控。环境因素如：毒素、感染、氧化压力、生活习惯（如吸烟酗酒）、肥胖等都会影响精子发生过程和精子功能，这些因素也是可能导致端粒缩短的因素［7］。因此，环境因素如氧化压力等与端粒间的相互作用以及端粒影响精子发生和精子功能的机制值得深入研究。本研究为男性不育的遗传与环境因素相互作用机制/病理生理意义提供了更多线索，有待进一步在更多病例和人群中进行验证，并深入开展功能学方面的研究。

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（责任编委： 苗龙）

Association study of telomere length with idiopathic male infertility

Shuyuan Liu1， Changjun Zhang2， Haiying Peng2， Xiaoqin Huang1， Hao Sun1， Keqin Lin1，Kai Huang1， Jiayou Chu1， Zhaoqing Yang1

1. Institute of Medical Biology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical college， Kunming 650118， China;
2. Reproductive of Medical Research Centre of People’s Hospital of Shiyan， Shiyan 442000，China

Telomeres are evolutionary conserved， multifunctional DNA-protein complexes located at the ends of eukaryotic chromosomes. Telomeres maintain chromosome stability and genome integrity and also play an important role in meiosis which aid in synapsis， homologous recombination， and segregation. Sperm telomere has been reported to play an important role in fertilization and embryo development. Nowadays， the association between telomere and reproduction is one of the major areas of interest， however whether sperm telomere associated with male infertility is not clear. In this study， in order to find out the association between Chinese idiopathic infertility and sperm telomere length， we analyzed the difference of sperm telomere length between idiopathic infertile men and normal fertile men，as well as the correlations between sperm telomere length and human semen characteristics. We analyzed 126 Chineseidiopathic infertile men and 138 normal fertile men for sperm telomere length by using quantitative PCR. We found that the relative sperm mean telomere length of infertile men was significantly shorter than that of fertile men（2.894±0.115 vs. 4.016±0.603， P=5.097×10-5）. Both sperm count and semen progressive motility are related with telomere length. Our results suggest that sperm telomere length is associated with idiopathic male infertility of China and we proposed the possibility thatshorter telomeres in sperm chromosome will reduce spermatogenesis and sperm functions， which finally affected the fertility of male.

telomere length； idiopathic male infertility； sperm count； sperm total motility

2015-06-05；

2015-08-19

国家高新技术研究发展计划（863计划）项目（编号：2012AA021802）资助

刘舒媛，博士，助理研究员，研究方向：疾病的遗传相关性。E-mail： liushuyuan@imbcams.com.cn

杨昭庆，博士，研究员，研究方向：疾病的遗传相关性。E-mail： zyang@imbcams.com.cn

10.16288/j.yczz.15-267

网络出版时间： 2015-8-289：25：49

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150828.0925.004.html