利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型

汪启翰，怀聪，孙瑞林，庄华，陈红岩，费俭，卢大儒

1. 复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海 200433；

2. 上海南方模式生物研究中心，上海 201203

利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型

汪启翰1，怀聪1，孙瑞林2，庄华2，陈红岩1，费俭2，卢大儒1

1. 复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海 200433；

2. 上海南方模式生物研究中心，上海 201203

血友病乙是由凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病，为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义，而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统，在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点，将Cas9 mRNA和带有靶位点的sgRNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中，获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting， HRM）技术进行精确基因分型，并通过测序验证，在60只小鼠中，总共有51只小鼠的靶位点发生了突变，突变率高达85%，其中雄鼠的突变率为79.5%，雌鼠的突变率为95.2%；未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示，突变小鼠的FⅨ活性值（Factor Ⅸ coagulant activity， FⅨ： C）是非突变小鼠的6.82%，大大低于非突变小鼠，表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明，利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。

血友病乙；CRISPR/Cas系统；基因组编辑；小鼠模型

血友病乙是由凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）缺乏或功能缺陷所引起的一种常见的伴X染色体隐性遗传病。在中国人群中，男性的发病率约为1/25000［1，2］。该病的临床特征是凝血功能障碍导致自发出血不止，或者凝血时间过长。目前，治疗血友病乙的唯一有效疗法为替 代疗法，即使用浓缩血浆、重组人凝血因子Ⅸ制剂、凝血酶原复合物进行输血治疗。随着病毒灭活技术的不断改进和重组蛋白的表达，替代疗法的安全性得到了保障。但由于FⅨ的半衰期短及反复输血导致患者的血管硬化等并发症，同时2%～4%的患者还会产生FⅨ抑制物，限制了替代治疗的有效性［2，3］。只有基因治疗才能根治遗传病，而通过构建小鼠模型来模拟人类疾病也成为深入研究和模拟基因治疗的有效途径。传统的小鼠模型构建过程繁琐，通常将含有突变型目的基因的质粒转入小鼠的胚胎干细胞（Embryo stem cells，ES cells）中，利用自发同源重组进行基因的置换，再将胚胎干细胞与受精卵融合后进行纯合突变小鼠的筛选［3，4］。该方法不仅效率低（ES同源重组的效率仅为10-2～10-5），而且筛选纯合小鼠过程耗时长，一般需要1年的时间才能得到疾病模型小鼠。此外，该方法无法实现精确位点的改造。

Ⅱ型CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/Cas9）系统是近几年发展极快的一种基因组编辑技术。该技术由一条短的单导向RNA（Single-guide RNA， sgRNA）引导Cas9核酸酶［5～7］在靶标DNA位置上进行精确的识别，造成DNA断裂并诱发细胞内DNA损伤修复。通过非同源末端连接（Non-homologous end joining， NHEJ）的修复方式，DNA断裂位点可能剪切或者随机插入若干碱基，从而造成断裂位点的基因突变，达到基因敲除的目的；或者当同源模板存在时，通过同源重组（Homologous recombination， HR）的修复方式，对目的基因进行碱基替换或者片段的插入，实现精确修改或者基因的敲入［6，7］。CRISPR/Cas9系统中的sgRNA通过碱基互补配对与DNA结合，决定了靶向的基因编辑的位置，而该系统对靶位点的唯一要求是在靶位点的3′端要具有NGG序列，即PAM（Protospacer adjacent motif）区［5～8］。因此根据靶位点对sgRNA进行特异性地设计，就能对基因组中的任意位点进行精确且高效地编辑，具有很高的自主性。因此，本文通过CRISPR/Cas9技术进行FⅨ基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径。

1　材料和方法

1.1材料

本实验所用小鼠品系为C57BL/6，由南方模式动物中心提供，于SPF（Specific pathogen free， SPF）级环境饲养。根据哺乳动物进行密码子优化的Cas9和sgRNA转录模板质粒为复旦大学姚纪华实验室惠赠。体外转录试剂盒购自Life Technologies公司，使用mMESSAGE mMACHINE®T7 Kit（AM1344）对Cas9 mRNA进行转录，使用MEGA shortscript™ T7 Transcription Kit（AM1354）对sgRNA进行转录。

1.2方法

1.2.1靶位点的选择

利用CRISPR/Cas9系统进行小鼠FⅨ基因的靶向编辑，编辑位点的选择按照以下原则：（1）靶序列20 bp后含有NGG的PAM序列；（2）靶位点编码具有核心作用的氨基酸；（3）由于本研究目的是构建模拟人类血友病乙的小鼠模型，因此选择与人基因组同源性高、在人类疾病中常见的突变位置作为靶序列。此外，为了减少非靶向位置的结合和编辑（脱靶效应），将靶位点序列在NCBI序列比对数据库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行全基因水平的比对，确保其具有高度唯一性。

1.2.2受精卵显微注射

根据选择的FⅨ位点，通过PCR法制备FⅨ-sgRNA转录模板，体外转录获得用于DNA靶向切割的sgRNA；以线性化质粒为模板，体外转录得到Cas9 mRNA。将50 ng/μL Cas9 mRNA、20 ng/μL sgRNA显微注射到小鼠受精卵细胞的细胞质，将注射之后存活的受精卵进行移植，至母鼠生产得到F0代小鼠。

将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1、F2代小鼠。

1.2.3基因分型与基因检测

剪取F0代及其子代小鼠尾尖组织0.5 cm，抽提基因组DNA。以基因组DNA为模板，用扩增引物HRM-F（5′-TGCCTTAGGTCCACAACATT-3′）和HRMR（5′-GCATTATTAGCTGGGGTGAA-3′）对包含靶标位置的DNA区域进行扩增，获得约150 bp的DNA，利用高分辨率熔解曲线分析法（High resolution melting analysis，HRMA）对小鼠FⅨ基因靶标位置进行基因分型，高分辨率熔解曲线分析使用Roche 480。

根据DNA变性的动力学原理，不同的基因序列其熔解温度（Melting-temperature，Tm）以及熔解曲线的峰型都不相同，因此对比野生型小鼠DNA样品的熔解曲线图，可以对靶标位置是否发生DNA突变进行精确检测［9，10］。同时，为了区分FⅨ靶标位置是否为纯合突变，将等量野生型小鼠的基因组DNA与待测小鼠DNA混合后进行扩增，并进行HRMA综合分析（图1）。

以测序法验证和确认F0及子代小鼠基因型。

1.2.4脱靶效应检测

研究表明，当目标DNA序列与sgRNA识别序列3′端的12个核苷酸有高度同源性时，CRISPR/Cas9系统可能会错误结合并切割［11］，因此利用NCBI数据库对FⅨ-sgRNA进行可能的脱靶位点进行分析，并利用HRMA进行脱靶效应检测。

图1　H RM基因分型检测

1.2.5模型小鼠凝血表型检测

腹腔注射苯巴比妥将F0代待测小鼠麻醉，断尾取血并加入1/10体积109 mmol/L枸橼酸钠抗凝，4℃、3000 r/min离心20 min得到血浆，并在ACL TOP 700 LAS凝血分析仪（Hemostasis analyzer）上进行检测凝血活性检测［12］。

2　结果与分析

2.1靶位点的选择

敲除基因需要选择关键的靶向位点，通过序列的突变从而造成基因功能的缺失。FⅨ基因包含8个外显子，共编码6个主要结构域。研究表明，人类血友病乙患者中第8外显子所编码的氨基酸突变率最高［1］，而且第8外显子也是内源性凝血途径中的关键性催化区域［1，2］。通过序列比对发现，人与小鼠在FⅨ基因的这个区域具有高度的同源性。因此本研究在小鼠FⅨ基因的第8外显子上选取了高特异性的靶向编辑位点，序列为GGAGGCAAAGATTCGTGTGA（AGG）。

2.2突变小鼠的获得

将Cas9 mRNA与sgRNA混合后，显微注射到小鼠受精卵的细胞质，将存活的280枚受精卵移植至14只假孕C57BL/6雌鼠，每个假孕雌鼠体内移植20枚受精卵。约3周后小鼠出生，共获得60只F0小鼠，出生率21.42%，其中雄鼠39只，雌鼠21只（表1）。

2.3小鼠基因分型结果

对60只F0代小鼠的基因组DNA进行HRM分型，结果显示51只小鼠在靶标位置发生DNA突变，即利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶的效率为85.0%（51/60），其中雄性小鼠的突变率为79.5%，雌性小鼠的突变率高达95.2%（表1）。纯合突变率51.67%，杂合突变率33.33%。

同时，测序结果证实CRISPR/Cas9系统可产生高的基因编辑效率，靶位点的具体碱基变化见图2。总的X染色体的突变率为79%，其中缺失型基因型占89.8%，远高于10.2%的插入型突变。另外，在5只突变的小鼠中检测到在靶位点发生约100 bp的重复插入，这可能跟DNA的损伤修复有关，其确切的作用机制还有待进一步研究。将其中5只突变小鼠与野生型小鼠交配传代，测序验证子代与亲代具有相同的基因型，证实突变的可遗传性。

表1　小鼠基因分型

2.4脱靶效应检测结果

通过在NCBI数据库比对，本文得到5个潜在的高风险脱靶位点（表2），利用HRMA对这5个位置进行基因突变检测及测序，没有检测出脱靶效应（附图1）。

2.5凝血活性检测

在F0代小鼠中，有30只小鼠在实验及饲养过程中因为流血不止而死亡。本文只对剩下的30只小鼠的凝血活性进行检测，包括9只非突变小鼠和21只突变小鼠，结果如图3所示。突变小鼠的FⅨ：C显著低于临床标准正常值（50%～150%），为非突变小鼠平均凝血活性的6.82%（P＜0.001）。其中非突变小鼠FⅨ活性为113.55±11.44% （n=9），雌性纯合突变小鼠活性为9.21±0.76% （n=4），雌性杂合突变小鼠为9.13±1.53% （n=6），雄性纯合子小鼠活性为6.87± 0.56% （n=7），雄性嵌合体小鼠为7.14±0.69% （n=4）。此外，无论突变小鼠是否为移码突变，所有被检测的突变小鼠的FⅨ：C均有所下降。

图2　部分突变小鼠的测序结果

表2　潜在的脱靶位点

图3　凝血活性检测

由于小鼠FⅨ的第414位氨基酸为FⅨ前体激活的关键磷酸化位点，而上述小鼠该位点均发生了缺失或突变，因此本文推测该位点的基因改变影响了小鼠内源性凝血的途径，导致上述移码及非移码小鼠的凝血活性均变低。

3　讨　论

以往构建基因缺陷小鼠模型的方法是在小鼠的受精卵中显微注射凝血因子Ⅸ大片段敲除的质粒，通过同源重组的方法来获得基因敲除小鼠，但是效率只有5%［3］，并且通过大片段敲除导致的基因缺失与人类血友病乙的基因突变类型为单碱基或者小片段突变的基因突变类型不同［1］，因此无法精确地模拟人类血友病B疾病的基因型。本文利用CRISPR/Cas9系统能够高效地将特异性靶位点的DNA双链打断，通过NHEJ修复方式，在断裂处随机引入碱基的缺失或者插入，使基因产生移码突变。但为了更好地模拟在外显子序列中由错义突变引起的人类遗传疾病，例如大部分人类血友病B的基因型，理论上可以显微共注射DNA同源模板，即利用HR方法，更加精确地构建特定基因型的小鼠模型。

对基因治疗来说，同样也是利用HR的修复方式，将错误的序列替换为正常序列。本文也成功地对血友病乙小鼠在受精卵水平上进行了初步的基因纠正。但是，目前HR的修复方式相比NHEJ的修复方式效率要低，因此对于如何提高HR的效率研究也具有十分重要的意义。另外，在CRISPR/Cas9系统应用中脱靶效应是人们所关注的重点之一。研究发现通过对Cas9核酸酶蛋白的切割域进行突变，利用修饰型的Cas9核酸酶可以使DNA双链的其中一条链断裂［6］，从而大大降低脱靶效应的产生。

本研究通过CRISPR/Cas9系统成功构建了血友病乙小鼠模型，未来将会利用CRISPR/Cas9系统构建精确碱基修改的突变类型的血友病乙小鼠模型，以及利用CRISPR/Cas9系统在生殖细胞和体细胞水平对所构建的血友病乙小鼠进行基因修复。

附录：附图见文章电子版：www.Chinagene.cn。

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（责任编委： 徐湘民）

A quick and efficient method to generate hemophilia B mouse models by the CRISPR/Cas system

Qihan Wang1， Cong Huai1， Ruilin Sun2， Hua Zhuang2， Hongyan Chen1， Jian Fei2， Daru Lu1

1. State Key Laboratory of Genetic Engineering， School of Life Science， Fudan University， Shanghai 200433， China;
2. Shanghai Research Center for Model Organisms， Shanghai 201203， China

Hemophilia B， or the Christmas disease， is a common human disease caused by coagulation factor Ⅸ（FⅨ） deficiency. It is an X-linked recessive hereditary disease. Here we obtained FⅨ-knockout mouse strains with phenotype of hemophilia B with the CRISPR/Cas system efficiently. We chose the 8th exon as the target locus，and co-injected codon-optimized Cas9 mRNA with sgRNA of FⅨ into C57BL/6 mice zygotes. We obtained 60 mice in total and genotyped them by high resolution melting （HRM） and sequencing. The results showed the mutation rate was 85.0% in total， and 79.5% and 95.2% in males and females， respectively. No off-targets were detected in the similar locus by HRM. We future measured the FⅨ activity of each mice. The FⅨ： C of mutant mice were significantly below the normal level and reduced to 6.82% of wild-type mice. The activity assay demonstrated that all the mutant mice were lack of FⅨ. In summary， we have generated hemophilia B model mice with extreme efficiency， using the RNA-guided Cas9 nuclease gene editing system.

hemophilia B； CRISPR/Cas system； genome editing； mouse model

附图1　相似位点的HRM分型结果图

2015-03-22；

2015-06-29

国家自然科学基金项目（编号：31571371）资助

汪启翰，硕士在读，专业方向：生物工程。Tel： 021-51630621；E-mail： zgzjfhwqh@gmail.com；

怀聪：博士在读，专业方向：人类医学分子遗传学。E-mail： huaic@fudan.edu.cn；

孙瑞林：博士，专业方向：基因功能的模式生物研究。E-mail： rlsun@126.com；

汪启翰、怀聪和孙瑞林同为第一作者。

卢大儒，博士，教授，研究方向：人类医学分子遗传学。E-mail： drlu@fudan.edu.cn

费俭，博士，教授，研究方向：基因功能的模式生物研究。E-mail：Jfei@tongji.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-117

网络出版时间： 2015-9-111：14：06

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150901.1114.004.html