溴量法测定银杏黄酮的研究

许小英，李梦耀，马岚，张敏，同禄禄

(1.长安大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710054;2.旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室(长安大学)，陕西 西安 710054)

黄酮类化合物具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂和抗肿瘤等药理作用［1-2］。近年来，银杏叶黄酮的提取和测定方法研究十分活跃［3］。银杏黄酮的测定方法主要有紫外分光光度法［4］、荧光光度法［5］、高效液相色谱法［6］、薄层扫描法［7］、毛细管电泳法等［8］。本文依据银杏黄酮的性质和结构的特点，建立并采用溴量法对黄酮类化合物的含量进行测定，该方法具有较高的准确度和精确度，操作方法简单、快捷、经济，适合于测定天然产物提取液中黄酮的含量。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

黄酮标准(芦丁)、溴酸钾、溴化钾、碘化钾、硫代硫酸钠等均为分析纯;重铬酸钾，优级纯;蒸馏水;银杏树叶(金黄色，洗净，阴干)。

AL204 电子天平;101-2AB 电热鼓风干燥箱;THZ-82 恒温振荡器。

1.2 黄酮标准液的配制

准确称取黄酮标准品0.664 6 g，加入少量乙醇微热至完全溶解，转移到200 mL 的容量瓶中，冷却到室温后，蒸馏水定容至刻度，即得到5 mmol/L 的黄酮标准贮备液。

1.3 测定原理

银杏叶中所含的黄酮类化合物主要是黄酮醇苷类成分［9-10］，其分子结构含有酚羟基，在一定条件下，可与溴分子发生亲电取代反应，只要能够确定与一分子黄酮起反应的溴分子数，就可用溴量法测定黄酮的含量。

测定原理用反应方程式表示如下:

Br2的生成 5KBr+KBrO3+6HCl→3Br2+3H2O+6KCl

取代 黄酮 +zBr2→取代产物+zHBr

滴定 Br2(剩余)+ 2KI →I2+ 2KBr

平行进行空白实验，确定加入溴的总量，用黄酮标准作为样品进行实验，计算反应系数z。

式中 z——与1 分子黄酮进行反应的Br2分子数;

1.4 测定方法

准确移取黄酮标准液(或银杏黄酮提取液)10.00 mL 于250 mL 碘量瓶中，加入0.05 mol/L 的溴试剂10.00 mL，微开瓶塞，加入6 mol/L 的盐酸3.00 mL，立即盖上瓶塞，用少量蒸馏水封口，稍微振荡，置于暗处30 min。微开瓶塞，加入10%的碘化钾5.0 mL，立即盖上瓶塞，摇匀放置5 min。加氯仿2 mL，轻轻振荡，使沉淀溶解。用硫代硫酸钠标准溶液进行滴定，当溶液颜色变为浅黄色时，加入2 mL淀粉指示剂，滴定直至溶液蓝色褪去，即为滴定终点。平行进行空白实验。按下式计算银杏提取液中黄酮的浓度。

式中 cH——样品溶液中银杏黄酮的浓度，mg/L;

2 结果与讨论

2.1 黄酮与Br2反应系数的确定

2.1.1 反应时间 保持溶液的酸度不变，加入溴的物质量为黄酮的7 倍，考察反应时间对反应系数的影响，结果见表1。

由表1 可知，反应时间对反应系数的影响不大，但是反应时间短，反应不完全;而反应时间较长时，溴又易挥发，不利于反应系数的测定，综合考虑，选择30 min 作为最佳反应时间。

表1 反应时间对反应系数的影响Table 1 The impact of reaction time on reaction coeffient

2.1.2 盐酸用量 其他因素不变，反应时间为30 min 时，考察6 mol/L 盐酸用量对反应系数的影响，结果见表2。

表2 盐酸用量对反应系数的影响Table 2 The impact of HCl amount on reaction coeffient

由表2 可知，盐酸用量对反应系数的影响不显著。但加入盐酸量较少时，使溴产生的不完全，影响反应系数的测定，选择加入的酸量为3.0 mL。

2.1.3 溴试剂用量 由表3 可知，在保证溴过量的情况下，溴试剂的量对反应系数没有显著影响，但溴试剂的加入量也不宜过多。通常情况下，溴过量20%即可，取n(Br2)∶n(黄酮)=5∶1。

表3 溴试剂用量对反应系数的影响Table 3 The impact of bromine reagent amounton reaction coeffient

2.2 样品分析

准确称取10 g 干的银杏叶于250 mL 圆底烧瓶中，加入60 mL 95%乙醇，在恒温水浴锅中，60 ℃下回流90 min，倾倒出滤液。重复上述步骤3 次，合并4 次提取液，取上清液测定银杏黄酮的含量，结果见表4。

由表4 可知，10 次测定同一银杏黄酮提取液，黄酮的平均浓度为1.674 g/L，各次测定数值接近，说明溴量法测定银杏黄酮提取液重现性较好。

表4 银杏黄酮样品含量测定结果Table 4 The content measurement results of Ginkgo biloba extract sample

2.3 精密度

实验数据的精密度分析结果见表5。

表5 银杏黄酮标准品精密度分析结果Table 5 The accuracy analysis results of Ginkgo biloba extract standard sample

由表5 可知，对提取液1 和提取液2，10 次测定标准偏差都较小，说明测定方法具有良好的可信度。

2.4 准确度

对样品进行加标回收实验，结果见表6。

表6 银杏黄酮加标回收率测定结果Table 6 The add mark recovery rate measurement results of Ginkgo biloba extract

由表6 可知，溴量法测定银杏黄酮提取液的加标回收率为97. 6% ～98. 8%，该方法较为准确，可靠。

3 结论

(1)依据黄酮可以和溴分子发生亲电取代反应，建立了一种溴量法测定黄酮的新方法，实验测得1 分子黄酮与5 分子溴反应亲电取代反应，溴与黄酮反应系数比为5∶1。

(2)溴量法测定1.674 g/L 银杏黄酮提取液，10次测定的标准偏差为6.48 ×10－5，加标回收率为97.6%，98.8%，方法准确、可靠，适用于天然植物提取液中黄酮的测定。

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