微生物在炎性关节病及人类风湿性疾病中的作用

黄林芳，肖欣悦，张　烜

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科 风湿免疫病学教育部重点实验室，北京 100730)

背景及研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种致残率较高的自身免疫性疾病，全球患者超过5 000万，它以滑膜炎为病理基础，目前与其发病相关的基因被不断发现和验证，如HLA-DRB1、TNFAIP3、PTPN22和PADI4等，更发现环境因素也参与了其发病[1- 4]，一项针对双胞胎RA的研究表明，基因遗传在其发病中所发挥的作用仅占60%[5]，个体需具备RA遗传背景、环境等综合因素，才能最终导致RA的发生[6]，近期越来越多的研究显示，环境因素中的微生物菌群被认为与RA发病密切相关。国际学术界也发现了肠道菌群和众多疾病密切相关[7]，包括消化道疾病(如肠炎[8])、代谢类疾病(如2型糖尿病[9])、传染性疾病(如肝硬化[10])，还有心脑血管疾病(如动脉粥样硬化[11])和免疫性疾病，个体想要维持健康状态，须在兼容有益微生物群的同时识别及对抗入侵物[12]。可以说，肠道菌群研究给诸多疾病的研究提供了一个非常好的切入点，然而目前对有关参与RA发病机制的微生物的研究还不够深入，从而阻碍了对RA更具有效性及特异性的治疗方法的探索。因此，全面了解RA相关的微生物菌群有助推动对RA病理生理的深入探索及早期诊断和精准医疗的实现。

随着大规模测序技术的出现，组学方法使我们更好地理解人类微生物组的组成和功能[13]。几十年来，科学家在实验室确认可培养的人体肠道内细菌种类为1 000～1 150种，而每个个体至少有160种细菌，表明细菌在个体中是具有多样性的，这或许与适应环境改变和受到宿主基因遗传性的影响有关[14]，研究发现，在任何时间，个体携带含有大约300万个蛋白编码基因的1～3 kg细菌[15]，同时，居住在不同生物领域独特的微生物菌团，也只能在特定的营养条件下生存[16]。人体的肠道微生物(通过1 000多个不同的物种代表)以一个成熟并对个体有益的方式进化着，并且提供酶来帮助我们从饮食中提取所需的基本维生素和氨基酸，在这一进化过程中逐渐形成了肠道微生物和宿主免疫反应之间的相互适应性。良好的肠道微生物群形成的免疫系统，能维持体内的平衡健康状态，菌群紊乱时则可导致炎症的发生[17]，包括肥胖、糖尿病、胃肠道癌症和动脉粥样硬化等，其中在自身免疫病领域最先报道的是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)[8]，其生态失调的过程以肠道有益微生物群种类的减少及肠道菌总量的增加为特征。

微生物在疾病发病过程中的潜在决定作用一直未被重视，随着现代微生物学的发展，微生物学技术的进步推动了微生物群的许多研究。17世纪，荷兰显微镜学家列文虎克通过对自己牙菌斑的研究，开拓了微生物学的研究道路。纽约大学免疫学家Dan Littman的研究也发现，肠道细菌对于Th17细胞的发育至关重要，正常无菌条件下饲养的小鼠生成的Th17细胞极少，但在实验过程中，他的研究小组发现购自一个供应商的小鼠相比于来自另一个不同供应商的小鼠具有更多的Th17细胞，结果表明，这一差异是由于小鼠的肠道微生物不同所导致的[18-19]。

肠道微生物是一个影响新陈代谢及免疫稳态的环境因素，每个个体肠道微生物的组成是相对稳定的[20-21]，但个体之间差异却很大[22]，它们覆盖在肠道上皮细胞，维持着机体的正常免疫、清除致病性微生物等功能。随着时间的推移，越来越多的研究开始关注疾病与特定的细菌和病毒的发病关系，包括RA、IBD、脊柱关节病(强直性脊柱炎和反应性关节炎)。微生物在自身免疫和其他风湿性疾病的作用已慢慢渗入我们的研究中，现代微生物学的报道进一步证实了肠道细菌感染可以引起关节炎这一假说，因此，人们也试图通过改变肠道细菌成分来治疗炎症性关节炎。一个典型的例子是柳氮磺胺吡啶，这一药物最终被视为改善病情的抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)，并被美国食品和药物管理局批准用于治疗RA和IBD，其他一些具有抗菌特性的药物也被用于RA的治疗。RA与菌群相关的研究逐渐开始被报道，研究证明初诊RA患者普氏菌增加而有益微生物减少，而普氏菌属的相对含量与表位共享基因的存在呈负相关，这表明人类肠道微生物的组成也可以部分地依赖于宿主基因组[23]。同类宏基因组之间也存在显著差异，虽然这尚未得到充分的研究，但这些变化可能与治疗反应的预测存在某些相关性，二氢叶酸还原酶水平丰富的宏基因组样本拟杆菌，可能与宿主二氢叶酸还原酶竞争甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)的结合和新陈代谢，因此RA患者微生物区高二氢叶酸还原酶含量的增加可能有助于解释为什么只有部分RA患者口服MTX有效。

综上所述，这些研究提示肠道微生物在RA发病机制中存在很大的作用。针对肠道细菌的治疗在最近几十年已被纳入治疗风湿病战略的一部分，许多组织正在试图通过调节菌群的组成成分以减轻炎症反应，目前正在使用从生态系统水平干预到针对单一靶目标的方法，采用亲密捐赠者的完整细菌菌落，试图用粪便微生物移植来恢复受者的“健康”肠道微生物[24]。粪便微生物移植在抗感染性结肠炎梭状芽胞杆菌已被证明是非常有效的，尽管取得了引人注目的结果，但这种技术的使用尚存在一系列挑战性，包括如何定义一个健康的微生物组、如何考虑一个合适的捐赠者等[25]。目前关于RA与肠道菌群的研究尚处于初始阶段。

重大研究结果

人类肠道微生物在自身免疫性疾病中的作用越来越被认可，对其认识的加深可能改变我们现在认为的生理和疾病状态。越来越多的研究表明，为了充分利用微生物的功能，人类通过保持低度的炎症状态来维持与肠道菌群的共生关系，然而，某些对共生微生物群相对组成的干扰可以改变肠道固有层内的免疫稳态，引起异常的免疫反应，随着越来越多的人类微生物组研究的应用，许多问题亟需更进一步的探索。

国内研究团队通过元基因组关联分析法，揭示了口腔和肠道微生物菌群或与类风湿关节炎的致病和保护机制相关[26]。

研究通过收集未经治疗及少数经DMARDs治疗的RA患者的粪便、牙菌斑和唾液样本，以健康人群(包括直系亲属和共同生活无血缘关系亲属)作为对照进行对比研究，并对治疗前后RA患者的口腔和肠道微生物菌群的变化进行对比研究，运用元基因组鸟枪法测序技术检测微生物组DNA[27]。研究共检测了212份粪便标本：77例初治RA患者、80例健康对照、17例初治RA及与其相应的17例健康亲属、21例DMARDs治疗过的RA患者，通过整合数据入已有的肠道微生物基因组数据库目录[28]，结果发现77例初治RA患者和80例健康对照肠道微生物的组成都具有多样性的特征，为了进一步明确RA相关肠道菌群组成结构的差异性，我们辨认了117 219个高表达于RA患者的基因标记，并且根据其变异丰度将这些基因整合入宏基因组关联组群(MLGs)[29]，形成了至少包含100个基因的88个MLGs，其中包括RA患者高表达的MLGs、对照组高表达的MLGs。结果发现，RA肠道高表达革兰阳性菌、低表达革兰阴性菌，同时脂多糖的合成、转运和分泌能力也低于健康对照，而还原性乙酰辅酶A通路的产生乙酸盐的细菌(如某些梭菌属)的表达是增加的，这些结果表明RA患者肠道微生物群不同于健康对照。

为进一步分析口腔微生物是否也与RA相关，该研究通过运用鸟枪法测序检测了105个牙菌斑标本：54例初治RA患者、51例健康对照；98例唾液标本：51例初治RA患者、47例健康对照，然后将这些序列重新整合入一个包含320万基因的基因数据库，通过牙菌斑和唾液标本，分别辨认了371 990和258 055个基因标记，采取同样的方法构建了MLGs，就目前所知，这是口腔肠道菌群的第一个宏基因组关联分析，同样，结果发现，RA患者口腔微生物群也是失调的。统一得出以下结论：与健康人群相比，RA患者的口腔与肠道菌群在氧化还原条件下，铁、硫、锌和精氨酸的转运和代谢以及RA相关抗原如瓜氨酸环化的分子拟态等方面均表现出明显异常，RA患者可检测到失调的肠道微生物群，包括升高的革兰阳性菌和降低的革兰阴性菌等，并且与其临床症状具有相关性，如自身免疫病相关抗体滴度，同时口腔微生物群也是失调的。

RA患者身体不同部位微生物菌群是否具有一致性或差异性的特点？研究者通过全基因组及代谢途径数据库(KEGG数据库)功能模块分析，发现肠道和口腔微生物菌群功能具有一致性特点，存在于口腔、肠道中的某种嗜血杆菌(Haemophilussp)在RA患者中呈现相对缺失的状态，并且与血清抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptides,CCP)、类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)和C反应蛋白(C-reactionprotein,CRP)的表达呈负相关。唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)在RA患者的牙菌斑、唾液和粪便中均明显增加，并且与IgG水平呈正相关，与低中度病情活动患者相比，病情高度活动的RA患者中表达更高，而在经过治疗之后的患者能部分恢复。揭示某些菌群异常在RA的主要病理生理机制如瓜氨酸环化异常中具有重要的作用，可能直接参与疾病发生。

为了验证与RA相关的肠道菌群的诊断价值，研究者通过肠道宏基因组关联方法构建了疾病随机森林分类器，通过对牙菌斑、唾液和粪便样本的元基因检测，形成的微生物菌群分类诊断模型对RA诊断的准确率可显著提高，其诊断准确率接近100%。该分类诊断模型还可帮助判断抗风湿药的疗效，并区分RA的不同疾病病程，从而进行疾病分层和药物疗效预警，同时研究者也对DMARDs治疗前后RA患者的口腔和肠道微生物菌群的变化进行了对比研究，结果发现经过治疗之后的患者能部分恢复失调的肠道菌群，尤其是口腔样本的结果。

理论意义和应用价值

该宏基因组关联分析定义了RA相关的肠道和口腔微生物的组成、功能的改变及DMARDs药物治疗后菌群部分恢复，口腔和肠道微生物之间具有一致性，并且与临床指标(如CRP、抗CCP、RF)相关，能初步地将RA患者分类，且粪便、牙菌斑和唾液标本都容易取得。这一综合性的调查表明，RA处于一个慢性炎症的阶段，致病性细菌过度生长或免疫调节性的共生体细菌缺乏将会促进或加重其发病。

这一研究结果被NatMed[30]和NatRewRheumatol[31]热点评价。NatMed热评：中国学者的这一发现不仅对RA的研究有重要作用，也提示我们健康微生物群的破坏导致异常的免疫调节可能是许多特发性炎症性疾病的潜在共性，包括：代谢综合征、2型糖尿病、动脉粥样硬化[32]和IBD[33]等，这些情况的形成可能是一个常见的生态失调的表现，可能是类似环境驱动、遗传倾向等共同导致的，这样一个模型可以解释常见的RA合并某些潜在炎症成分共存的疾病，最值得注意的是心脏病和抑郁症[34]。宏基因组关联分析研究的发展，提供了一个有利的条件，通过这些条件识别肠道微生物群的共性，并且进一步分析身体其他部位的失调及炎症紊乱之间的关系，从鸟枪法测序到元转录组分析的扩展，使细菌的潜在功能及不同基因的表达都得到了特征性描述，也可以让我们更进一步了解微生物群。

结　　论

这一研究是国际上首次同时进行的口腔和肠道微生物菌群元基因组关联分析，揭示肠道菌群异常在人类重大慢性非感染性疾病中的机制和临床意义，对此开展进一步的临床验证将有利于深入了解RA发病机制，并有望对RA疾病分层、药物疗效预警及寻求新型治疗靶点从而达到对疾病的精准诊疗起到积极推动作用，并为元基因组学辅助的RA个性化诊疗方案提供基础。哈佛医学院免疫学家Diane Mathis说：“多年来一直怀疑，在人类和动物模型中像关节炎一类的自身免疫疾病的形成依赖于肠道微生物群。现在，这些怀疑开始在人体中得到证实，这是一个非常惊人的研究发现。”我们目前还在继续这方面的研究，进一步观察这一部分患者在治疗2年后临床症状及实验室指标与肠道及口腔微生物的相关性。

[1]Raychaudhuri S，Sandor C，Stahl EA，et al.Five amino acids in three HLA proteins explain most of the association between MHC and seropositive rheumatoid arthritis[J].Nat Genet，2012，44：291-296.

[2]Viatte S，Plant D，Raychaudhuri S.Genetics and epigenetics of rheumatoid arthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2013，9：141-153.

[3]Okada Y，Wu D，Trynka G，et al.Genetics of rheumatoid arthritis contributes to biology and drug discovery[J].Nature，2014，506：376-381.

[4]Jiang L，Yin J，Ye L，et al.Novel risk loci for rheumatoid arthritis in Han Chinese and congruence with risk variants in Europeans[J].Arthritis Rheumatol，2014，66：1121-1132.

[5]MacGregor AJ，Snieder H，Rigby AS，et al.Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins[J].Arthritis Rheum，2000，43：30-37.

[6]McInnes IB，Schett G.The pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].N Engl J Med，2011，365：2205-2219.

[7]Tilg H，Moschen AR.Food，immunity，and the microbiome[J].Gastroenterology，2015，148：1107-1119.

[8]Huang H，Vangay P，McKinlay CE，et al.Multi-omics analysis of inflammatory bowel disease[J].Immunol Lett，2014，162：62- 68.

[9]Forslund K，Hildebrand F，Nielsen T，et al.Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota[J].Nature，2015，528：262-266.

[10] Qin N，Yang F，Li A，et al.Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis[J].Nature，2014，513：59- 64.

[11] Vinjé S，Stroes E，Nieuwdorp M，et al.The gut microbiome as novel cardio-metabolic target：the time has come[J].Eur Heart J，2014，35：883- 887.

[12] Lee YK，Mazmanian SK.Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system[J].Science，2010，330：1768-1773.

[13] Franzosa EA，Hsu T，Sirota-Madi A，et al.Sequencing and beyond：integrating molecular ‘omics’ for microbial community profiling[J].Nat Rev Microbiol，2015，13：360-372.

[14] Qin J，Li R，Raes J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature，2010，464：59- 65.

[15] NIH HMP Working Group，Peterson J，Garges S，et al.The NIH Human Microbiome Project[J].Genome Res，2009，19：2317-2323.

[16] Human Microbiome Project C：Structure，function and diversity of the healthy human microbiome[J].Nature，2012，486：207-214.

[17] Littman DR，Pamer EG.Role of the commensal microbiota in normal and pathogenic host immune responses[J].Cell Host Microbe，2011，10：311-323.

[18] Wu HJ，Ivanov，II，Darce J，et al.Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells[J].Immunity，2010，32：815- 827.

[19] Longman RS，Yang Y，Diehl GE，et al.Microbiota：host interactions in mucosal homeostasis and systemic autoimmunity[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2013，78：193-201.

[20] Faith JJ，Guruge JL，Charbonneau M，et al.The long-term stability of the human gut microbiota[J].Science，2013，341：1237439.

[21] Schloissnig S，Arumugam M，Sunagawa S，et al.Genomic variation landscape of the human gut microbiome[J].Nature，2013，493：45-50.

[22] Yatsunenko T，Rey FE，Manary MJ，et al.Human gut microbiome viewed across age and geography[J].Nature，2012，486：222-227.

[23] Scher JU，Sczesnak A，Longman RS，et al.Expansion of intestinal Prevotella copri correlates with enhanced susceptibility to arthritis[J].Elife，2013，2：e01202.

[24] van Nood E，Vrieze A，Nieuwdorp M，et al.Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile[J].N Engl J Med，2013，368：407- 415.

[25] Colman RJ，Rubin DT.Fecal microbiota transplantation as therapy for inflammatory bowel disease：a systematic review and meta-analysis[J].J Crohns Colitis，2014，8：1569-1581.

[26] Zhang X，Zhang D，Jia H，et al.The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment[J].Nat Med，2015，21：895-905.

[27] Tringe SG，von Mering C，Kobayashi A，et al.Comparative metagenomics of microbial communities[J].Science，2005，308：554-557.

[28] Li J，Jia H，Cai X，et al.An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome[J].Nat Biotechnol，2014，32：834- 841.

[29] Qin J，Li Y，Cai Z，et al.A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J].Nature，2012，490：55- 60.

[30] Rogers GB.Germs and joints：the contribution of the human microbiome to rheumatoid arthritis[J].Nat Med，2015，21：839- 841.

[31] Phillips R.Rheumatoid arthritis：Microbiome reflects status of RA and response to therapy[J].Nat Rev Rheumatol，2015，11：502.

[32] Devaraj S，Hemarajata P，Versalovic J.The human gut microbiome and body metabolism：implications for obesity and diabetes[J].Clin Chem，2013，59：617- 628.

[33] Hedin C，van der Gast CJ，Rogers GB，et al.Siblings of patients with Crohn’s disease exhibit a biologically relevant dysbiosis in mucosal microbial metacommunities[J].Gut，2016,65(6):944-953.

[34] Halaris A.Inflammation，heart disease，and depression[J].Curr Psychiatry Rep，2013，15：400.