氨基肽酶与类风湿关节炎

赵　琴，许夏雨，丁界先，张　燕，沈海丽

(兰州大学第二医院风湿科，兰州 730030)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)主要是因为效应T细胞和抑制性T细胞比例失衡主导的、由肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)等多种细胞因子引起的以滑膜炎为主要病理改变的自身免疫性疾病，具体病因及发病机制没有统一定论[1]。氨基肽酶(Aminopeptidase N，APN)广泛表达于肾脏细胞、神经细胞、骨髓细胞、内皮细胞、滑膜细胞等多种细胞表面，又名为CD13[2]；使用ELISA方法在血清中也能检测到APN[2]。肿瘤转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)能上调APN的表达[2]。血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路诱导APN的转录[3]。APN能移除多肽如趋化因子CXCL11、Ⅳ型胶原、胞外基质酶等N端的中性氨基酸，从而对多肽进行翻译后修饰调节[2]。APN还是冠状病毒、人巨细胞病毒等多种病毒的受体[2]，可增加滑膜细胞对病毒的易感性。RA的病因不明确，可能因冠状病毒等病毒感染后产生多种病毒蛋白通过分子模拟引发自身免疫反应，滑膜细胞表面上调的CD13分子为病毒的感染提供了组织特异性靶点，加重了关节的损伤。此外APN还参与了细胞的信号转导通路，它参与细胞的凋亡、T淋巴细胞的趋化、毛细血管形成、肿瘤细胞的浸润和转移、摄取胆固醇以及调节机体的免疫功能[4]。推测APN可能在RA病变进展过程中有重要作用。

APN的结构

APN的编码基因在15号染色体(q25-q26)，分子量150 kD，包含三个特征性的结构域，即HEXXH序列、GXMEN基序以及锌原子结合区，属于锌金属蛋白酶M1家族[4]。由于APN的胞内段较短并且不含已发现的信号转导基序，故APN不能直接引发下游信号通路，需要借助与APN胞内段结合的一些小分子蛋白来传递信号。这些小分子蛋白是目前研究的热点，已报道的小分子蛋白包括半乳凝集素-3(galectin-3)、半乳凝集素- 4(galectin- 4)、逆转诱导富含半胱氨酸的蛋白质(reverse the induced protein rich in cysteine，RECK)以及肿瘤相关抗原- 6(tumor-associated antigen- 6，TAA- 6)。

APN在RA的病程进展中的作用

将RA患者的关节滑膜进行组织染色并与骨关节炎患者及正常人的滑膜组织对比，发现RA患者的关节滑膜中APN的表达较正常人增高，并且也高于骨关节炎患者滑膜中APN的表达水平[5]。进一步通过流式细胞仪和RT-PCR技术分析RA患者关节滑膜的成纤维样细胞表面APN的表达明显升高，APN的mRNA表达量增加[6]。推测APN可能在RA的病理改变过程中发挥重要作用。

APN对RA细胞免疫的调节作用

RA被普遍认为是细胞免疫引发的系统性自身免疫性疾病。树突状细胞在细胞免疫中起重要作用，树突状细胞表面的APN上调后通过磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)通路促进树突状细胞的活化和分化，从而向T细胞和B细胞递呈自身抗原，启动细胞免疫和体液免疫[7-8]。APN一方面能使TNF-α受体脱落，TNF-α受体脱落后与TNF-α结合，从而减少了TNF-α与中性粒细胞的结合，调节中性粒细胞脱颗粒、呼吸爆发引起的组织细胞损伤[9]。另一方面TNF-α受体脱落后与TNF-α结合，保护TNF-α不被血清中的酶降解，也能使TNF-α不断结合到巨噬细胞表面使之活化，活化后的巨噬细胞趋化更多的T淋巴细胞，分泌更多的TNF-α，持续造成关节软骨的破坏。这可能是RA病程慢性进展的原因之一。除了调节TNF-α的作用以外，APN也能调节同RA发病密切相关的细胞因子IFN-γ、IL-17和TNF-α的产生。取脾细胞进行培养，抑制APN作用之后，脾脏特异T淋巴细胞的复制以及细胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α的产生也受到抑制[10]。然而这种抑制现象是通过什么机制发挥作用的尚不清楚。用脂多糖刺激巨噬细胞分泌TNF-α，通过蛋白免疫印迹Western-blot方法检测发现细胞内信号蛋白分子核转录因子(NF-kappaB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK/JNK)的表达量增加；而抑制NF-kappaB活化和MAPK、JNK磷酸化，则会抑制TNF-α的产生[11]。细胞信号转导分子NF-kappaB、MAPK、JNK可能参与TNF-α的产生。有研究发现抑制磷脂酰肌醇3激酶通路(PI3K/Akt)和NF-kappaB会抑制IL-17的产生[12]，细胞信号转导分子PI3K/Akt、NF-kappaB可能参与IL-17的产生。APN信号转导下游能引发信号分子NF-kappaB、MAPK、JNK、PI3K活化[13]，推测RA患者滑膜细胞表面上调的APN也能促进IFN-γ，IL-17和TNF-α的产生。

抑制APN可能减缓关节软骨的破坏

应用ELISA方法检测发现RA患者血清明胶酶A(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)和明胶酶B(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的水平升高[14]。它们参与基质的降解、骨质破坏以及调节成纤维细胞的增殖。分离RA患者的成纤维样滑膜细胞进行培养，抑制MMP-2和MMP-9会抑制RA成纤维样滑膜细胞的增殖[15]。MMP-2和MMP-9除参与成纤维细胞的增殖以外，还会促进IL-1β、白细胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)、TNF-α产生，促进成纤维样滑膜细胞的存活、迁移和浸润和加剧软骨的破坏[15]。因此MMP在RA患者的关节软骨破坏过程中起关键作用。应用Western-blot方法检测发现MMP-2和MMP-9的水平升高之后，细胞内的信号蛋白分子MAPK、JNK、NF-kappaB的水平随之升高[13]。推测MAPK、JNK、NF-kappaB可能是MMP活化后下游信号转导通路的信号分子。反之，在骨肉瘤细胞中抑制MMP-2和MMP-9的活性或减少它们的表达量，通过Western-blot方法检测发现骨肉瘤细胞内信号转导分子MAPK家族成员p38、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)、JNK以及PI3K、NF-kappaB水平均下降[13]。利用IL- 6刺激APN的表达后，瘤细胞的浸润和转移增加、MMP活性增强、MAPK、PI3K、NF-kappaB的含量均增加[13]。因此APN可能位于细胞信号转导通路的上游，促进MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9可能通过胞内信号蛋白分子MAPK、JNK、NF-kappaB促进软骨破坏。抑制APN的作用，可能会从细胞信号转导通路的上游抑制基质金属蛋白酶的产生，抑制骨质破坏。

APN参与T淋巴细胞的趋化，促进RA关节破坏

用IL-17诱导类风湿性关节炎动物模型的滑膜纤维样细胞表达APN，T细胞数目增加[5]。并且抑氨肽酶素(bestatin)抑制APN的作用后会明显抑制淋巴细胞的趋化能力[6]。此外下调APN的表达能抑制放线酰胺素、肝素引起的趋化CD4+T细胞的迁移效应[10]。因此，推测APN会影响T细胞的趋化。RA患者增生的滑膜巨噬细胞有两种来源，一是血液循环中的巨噬细胞，二是滑膜组织原来存在的巨噬细胞。APN能促进巨噬细胞分泌趋化因子吸引T细胞，滑膜中T细胞浸润分泌细胞因子TNF-α、IL-17等促进关节软骨破坏[16]。在RA中，中性粒细胞的比例小于淋巴细胞比例，淋巴细胞可以产生趋化因子吸引淋巴细胞及巨噬细胞向滑膜浸润，T细胞活化又能促进APN的表达，所以APN的上调可能是T细胞在RA病理过程中的正反馈效应。APN的上调能促进毛细血管形成以及巨噬细胞、淋巴细胞的趋化。因此通过抑制APN的作用，可能会抑制RA血管翳形成，从而减轻关节软骨的破坏程度。

APN参与血管形成

APN参与毛细血管形成、内皮细胞运动及粘附。APN交联后可以活化局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)，引起细胞骨架改变，诱导间充质干细胞黏附和迁移[17]。在受到血管生成信号后，活化的内皮细胞表面APN的表达上调，人为干预APN的作用后毛细血管的形成受到影响。bestatin作用于内皮细胞48 h后，血管内皮生长因子基因表达下降。bestatin作用于内皮细胞72 h后抑制了内皮细胞微管蛋白形成[18]。因此，推测APN可能参与血管生成的调节。此外APN可能还参与调节血管生成过程的启动环节。分别从野生型和APN基因敲除的大鼠的骨基质细胞中分离间充质干细胞，正常的间充质干细胞能够分化为血管内皮细胞，但是APN基因敲除大鼠的干细胞则无法分化成血管内皮细胞。因此APN可能是血管形成的必要条件。RA患者的滑膜病理改变基础是滑膜中出现由新生毛细血管和炎性细胞组成的血管翳，血管翳的形成与关节结构的破坏直接相关。APN在体外细胞实验中参与血管生成的启动和调节，因此推测RA血管翳的形成可能也与滑膜细胞表面上调的APN有关。

APN可能参与调节滑膜细胞的增殖

APN/CD13单抗作用于绒毛膜癌细胞、白血病细胞能够阻止它们的增殖，bestatin作用于肿瘤细胞模型ES-2细胞株能够明显抑制其增殖活性[19]。在卵巢癌细胞株(SKOV-3细胞株)中也会产生抑制作用[20]。推测APN可能参与调节细胞分裂，能促进细胞增殖。APN下游的信号转导小分子半乳凝集素-3(galectin-3)和凋亡相关调控蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)的结构特征相似[21]，能防止线粒体破坏和细胞色素C的释放[22]，具有抗凋亡的作用。RA的主要病理改变包括滑膜细胞增殖，滑膜增厚。滑膜细胞分为两类，包括具有巨噬细胞样功能的A细胞和纤维母细胞样的B型细胞。推测RA患者关节滑膜细胞大量增殖可能也受APN的调节作用。但是阻断APN的作用是否能中断或减缓滑膜细胞的增殖尚无试验证实。由于抑制APN能抑制肿瘤细胞增殖，所以APN抑制剂对RA合并肿瘤的患者及由于长期服用生物制剂而引发肿瘤的患者提高长期生存率有重要意义。

APN可能与RA血脂水平升高有关

RA患者与健康人相比，血脂存在明显异常，并且在RA活动期血脂异常水平高于RA缓解期，而血脂异常是RA患者并发动脉粥样硬化的危险因素[23]。但是，造成RA患者血脂升高的原因并不清楚。依折麦布(Ezetimibe Tablets)(临床治疗高脂血症的药物)和APN结合能引起小肠细胞细胞膜上的脂伐内翻，下调细胞表面摄取胆固醇相关的蛋白，通过改变APN的构象影响APN与Fc受体(免疫球蛋白F段C末端受体)的交联，抑制肠道对胆固醇的摄取从而降低血低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平[24]。而RA患者产生细胞因子如IFN-γ、TGF-β能诱导滑膜APN的表达增加，APN能促进肠道对外源性胆固醇的摄取，由此推测可能是RA患者小肠黏膜上皮细胞表达的APN上调，从而促进对外源性胆固醇及甘油三酯的摄取，使RA患者的血清LDL增加。下调APN的表达可能降低RA患者的血脂水平，防止动脉粥样硬化的发生。

展　　望

APN的上调参与趋化淋巴细胞浸润关节滑膜、促进RA患者的关节软骨破坏，启动和调节血管翳形成。推测其在RA病理改变过程中起全面调控的作用。目前对APN的研究多是通过APN单抗进行的细胞实验研究，整体的APN缺陷的RA动物模型很少，这在一定程度上限制了APN对完整动物体的作用的研究。并且APN对细胞增殖、调节IL-17和TNF-α产生的下游信号转导机制仍需进一步研究。除此以外，APN不仅可能是RA的危险因素，而且能够促进肿瘤的浸润和转移，目前针对RA治疗的传统药物主要是改善病情的传统的抗风湿药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)及生物制剂，在一定程度上缓解了患者的关节症状，但是不能达到完全缓解，且药物起效时间长、长期使用会引发感染、肿瘤等副作用，其安全性和疗效有待提高。APN可能参与RA的病理发展进程，因此抑制APN的作用可能对RA的发病有缓解作用，APN抑制剂可能是RA治疗的另一靶点，值得进一步研究。

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