过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

李秀鹏，杨套伟，徐美娟，张显，饶志明（江南大学生物工程学院，江苏无锡）

过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

李秀鹏1，杨套伟2，徐美娟3，张显4，饶志明*
（江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株，但是在2，3-丁二醇（2，3-BD）的发酵过程中，会积累较多的副产物乙偶姻（AC）。乙偶姻还原酶是催化AC合成2，3-BD的关键酶。为了提高2，3-BD合成效率，首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到B.subtilis 168，构建了重组菌B.subtilis 168/pMA5-acr。对重组菌进行摇瓶发酵实验，结果表明，相比出发菌，重组菌的2，3-BD产量和转化率分别提高28.62%和22.87%，主要副产物AC积累量下降了20.01%。同时，分支路径的副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸，也有不同程度的降低。

乙偶姻还原酶；2，3-丁二醇；乙偶姻；枯草芽孢杆菌

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD），化学式是CH3CHOHCHOHCH3，其结构存在3种立体异构体［1］，分别为L-（+）-、D-（-）-和meso-构型。作为一种重要的化工原料和液体燃料，2，3-BD被广泛应用于化工、能源、食品及航空航天等多个领域［2］。随着经济社会的蓬勃发展和石油等不可再生资源的日益枯竭，2，3-BD逐渐受到世界的关注。由于2，3-BD结构特殊［3］，利用化石原料生产2，3-BD成本高、条件苛刻、过程繁琐，容易对环境造成污染，并且化石原料日益枯竭，因此化学合成法工业化生产较为困难。微生物转化法是利用可再生资源生产2，3-BD，既克服了化学法生产的原料问题，又符合绿色化工的要求，因此受到了人们越来越多的关注。通过代谢工程、合成生物学及其集成的方法改造微生物［4］，同时，通过优化发酵条件与分离纯化工艺来降低环境污染与生产成本，对我国低碳经济和循环经济的建设，具有重要的促进作用和潜在的经济效益［5］。早在1906年，Harden和Walpole［6］就研究了利用肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneμmoniae）发酵生产2，3-BD；1926年，Donker［7］提出了用多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）发酵生产2，3-BD；1933年，Fulmer等［8］提高了产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）生物合成2，3-BD的水平，并指出了其工业化生产的潜力。2，3-BD高产菌株主要是克雷伯氏菌、产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌［3，9-10］。然而，这些菌株都具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求。

作者所在实验室保藏的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产2，3-BD的菌株，其代谢产生的2，3-BD主要以D-（-）-和meso-两种构型存在［1］。枯草芽孢杆菌的2，3-BD合成途径［1，11］如图1所示，以糖类为底物经丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻（Acctoin，AC）并最终转化为2，3-BD，此步反应需要NADH的参与［5，9］，同时伴随着有机酸的合成［12］。乙偶姻还原酶（Acctoin，reductase，ACR）作为一种双功能酶可催化AC和2，3-BD之间的相互转化［12］：在弱酸性的条件下，该酶以催化AC向2，3-BD转化为主，过程中消耗NADH；弱碱性时，该酶则主要催化2，3-BD向AC逆向转化，该过程生成NADH［13-14］。因此，有机酸副产物如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸的合成会与2，3-BD合成途径竞争碳源；另外，乳酸和琥珀酸的合成还会消耗NADH［1，11］，这可能会影响AC 向2，3-BD转化的程度，从而造成AC的大量积累。

图12　，3-丁二醇代谢路径Fig.1　Metabolic pathway of 2，3-BD.E；acetoin reductase

以B.subtilis 168作为出发菌，克隆乙偶姻还原酶基因acr，构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/ pMA5-acr，并对其在弱酸性的条件下进行发酵试验，研究过量表达ACR对发酵过程中2，3-BD积累的影响，希望能达到2，3-BD提高、AC和相关有机酸减少的目标，为工业化应用打下基础。

1　材料与方法

1.1菌种与质粒

Bacillus subtilis 168由作者所在实验室保藏，表达载体pMA5亦由作者所在实验室保藏。

1.2主要试剂与培养基

工具酶，购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、抗生素、咪唑，购自上海Sangon公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，购自Ferments公司；NADH，NAD+，购自Sigma Aldrich公司；PCR引物，由上海Sangon公司合成；其他试剂均为国产试剂。

活化培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；自然pH值。

种子培养基（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；自然pH值。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖140，酵母膏5，KH2PO46，K2HPO4·3H2O 14，尿素5，玉米浆20，柠檬酸钠8；pH 6.5。

1.3主要试剂配制

A液（50 mmol/L磷酸氢二钠溶液）：7.08 g Na2HPO4，加去离子水定容至1 L。

B液（50 mmol/L磷酸二氢钠溶液）：5.99 g NaH2PO4，加去离子水定容至1 L。

磷酸钠缓冲液（pH 6.5）：将A液和B液按照31.5∶68.5的体积比混匀。

PBS缓冲液（pH 7.0）：NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.626 g/L，用浓盐酸调至pH 7.0。

1.4乙偶姻还原酶基因acr克隆及表达载体构建

根据NCBI中枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列acr的基因序列设计一对引物，见表1，并在引物5′端分别加上BamH I和Mlu I酶切位点（下划线）。

表1　文中所涉及的引物Table 1　Primers used in the study

提取B.subtilis 168的基因组作为模板，以Forawrd/Reverse引物进行PCR扩增，获得目的基因片段acr。PCR总反应体系为50 μL，包含1 ng的质粒模板，200 μmol/L dNTP，20 μmol/L引物和1 μL 的ExTaq DNA聚合酶。程序设定为95℃预变性5 min；循环扩增程序为95℃变性50 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s（根据实际情况，时间设定为1 kb/min），35个循环；72℃延伸10 min。PCR反应产物用0.8 g/dL的琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带经分离后，用胶回收试剂盒（Takara）回收，回收的基因片段与pMD18-T连接，转化E.coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切验证，重组质粒命名为T-acr，DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。经测序验证正确的重组质粒T-acr，用BamH I和Mlu I双酶切后连接到经过相同酶切的pMA5上，构建表达载体pMA5-acr。

1.5ACR在枯草芽孢杆菌中的表达

将构建好的表达载体pMA5-acr转化至B. subtilis 168中，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性重组子并进行酶切验证。将验证正确的重组菌B. subtilis 168/pMA5-acr，接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基37℃过夜培养，次日以体积分数1%的接种量转接至50 mL LB液体培养基37℃培养24 h。发酵的菌液8 000 r/min离心10 min，用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤细胞3次，然后离心后的细胞重悬浮于pH 7.0的PBS缓冲液中，用超声波破碎仪破碎细胞，10 000 r/min离心30 min沉淀细胞碎片，上清液即为粗酶液，置于-4℃保存，后续用于蛋白质纯化、SDS-PAGE实验和ACR的酶活测定。

1.6酶的Ni-TNA纯化

超声破碎制得粗酶液后，经0.45 μm滤膜过滤，采用Ni-NTA蛋白纯化柱来纯化目的蛋白质，经过两次上样，蛋白质末端的6个His与Ni-NTA的金属离子螯合。洗脱过程，首先用不含有咪唑的缓冲液洗柱，洗脱掉未与Ni-NTA结合的细胞体杂蛋白质，然后用不同浓度的咪唑（20～300 mmol/L）缓冲液进行梯度洗脱，在一定的咪唑浓度条件下，可以得到较纯的酶液。

1.7重组蛋白质表达情况分析

利用SDS-PAGE分析重组菌的全细胞蛋白质［15］，用5 g/dL的浓缩胶及12～15 g/dL分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白质分离，考马斯亮兰R-250染色；总蛋白质浓度采用Brandford方法，以牛血清蛋白质（BSA）作为标准蛋白质［16］。

1.8ACR酶活力的测定

将20 μL粗酶液加入到酶活力测定缓冲体系，立即检测340 nm处吸光值在3 min内的变化。

乙偶姻还原酶活力测定缓冲体系：0.05 mol/L AC，5 mmol/L NAD+，磷酸钠缓冲液pH 6.5。

总酶活力（U/mL）定义：每毫升粗酶液OD600 nm每分钟消耗1 μmol/L NADH的酶量。

比酶活（U/g）定义：总酶活（U/mL）和粗酶液蛋白质质量浓度（g/mL）的相除值。

1.9摇瓶发酵产2，3-BD实验

重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/pMA5-acr和出发菌株B.subtilis 168经过LB液体培养基活化后，按体积分数1%的接种量转接至10 mL种子培养基，37℃培养12 h后按照体积分数4%的接种量转接至50 mL发酵培养基于37℃培养，发酵过程跟踪监测菌体浓度、葡萄糖含量、相关有机酸含量、AC产量和2，3-BD产量。

1.10发酵参数分析方法

1）AC和2，3-BD含量测定：采用毛细管气相色谱法检测，仪器型号GC1600（JieDao TECH），色谱柱规格为柱长30 m，内径0.32 mm，液膜厚度0.50 μm；检测条件为柱箱温度160℃，进样器和检测器温度250℃，进样量0.2 μL，采用FID检测器。

2）葡萄糖含量测定：采用SBA生物传感器测定，发酵液经适当稀释后，取25 μL直接进样到生物传感器中，根据葡萄糖标准样品浓度、仪器读数及发酵液稀释倍数计算发酵液中葡萄糖的含量。

3）OD测定：取一定量的种子培养液或发酵液，以相应的培养基作对照液，在600 nm处测定OD值。

4）有机酸产物含量测量：采用高效液相色谱（HPLC）测定，流动相为含有体积分数5%甲醇的50 mmol/L的KH2PO4，体积流量为1.0 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，温度为30℃。

2　结果与分析

2.1acr的克隆及其表达载体的构建

提取B.subtilis 168的基因组为模板，以Forawrd/Reverse引物进行PCR扩增，得到包含18 bp His编码序列的基因片段，总长1 041 bp，见图2。

图2　acr基因的PCR扩增Fig.2　PCR amplification of acr gene

将目的基因片段，连接到经BamH I和Mlu I酶切的pMA5上，构建表达载体pMA5-acr，并且转化至B.subtilis 168感受态中。获得的重组表达载体pMA5-acr经BamH I和Mlu I双酶切验证（见图3），得到约7 200 bp和1 040 bp大小的片段，刚好对应线性化的pMA5和acr的大小，表明外源基因acr已经正确连接到表达载体pMA5上。

2.2ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的表达

将重组载体pMA5-acr转化至B.subtilis 168，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性重组子，即得B. subtilis 168/pMA5-acr，将其接种于LB液体培养基培养24 h，收集菌体并破碎，菌体用pH 7.0的PBS缓冲液悬浮，采用超声波破碎细胞，将破碎上清液及其纯化蛋白质进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，ACR的相对分子质量约为39 kDa，与预期的蛋白质相对分子质量大小相符，表明ACR在B. subtilis 168/pMA5-acr中成功获得了表达。

图3　重组质粒pMA5-acr的酶切验证Fig.3　Identification of the recombinant plasmid pMA5-acr by enzyme digestion

图4　ACR表达与纯化的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ACR

2.3ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的酶活力测定

分别测定重组菌和原始菌破碎上清液中ACR的酶活力，结果如表2所示，与原始菌株相比，重组菌中ACR的比酶活提高了3.48倍，表明ACR在B. subtilis 168里成功过量表达。

表2　B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr的ACR酶活Table 2　ACR enzyme activities of B.subtilis 168 and B. subtilis 168/pMA5-acr

2.4过量表达ACR对菌体生长、糖耗和2，3-BD积累的影响

对B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr进行发酵实验，菌体量和葡萄糖变化曲线见图5，AC和2，3-BD发酵曲线见图6，发酵特征分析见表3。重组菌在前期的生长速度较慢，发酵培养16 h后，菌体生长速度加快，80 h达到最高菌体量。可能的原因是ACR的过量表达，加重了菌体的负担，前期生长受到抑制。但是过量表达ACR后，对菌体生长有害的分支路径副产物有机酸等减少了，所以后半段的菌体长势较好，菌体量也比出发菌高，使得2，3-BD的合成具备良好的细胞基础。

图5　发酵过程中OD和糖耗曲线Fig.5　Curves of OD and Glucose during the fermentation

从图5可以看到，重组菌的葡萄糖变化是一个前期下降平缓，中后期较为迅速的过程，而出发菌的糖耗曲线则较为均衡。这种现象表明，过量表达ACR，对菌体的生长造成负担。在前期，菌体生长缓慢，对于碳源的消耗减少，葡萄糖质量浓度下降较为平缓；而当菌体进入2，3-BD合成期后，对碳源的需求大大加强，发酵培养16 h，葡萄糖质量浓度开始较快减少。

图6和表3显示，发酵培养80 h，重组菌的2，3-BD的产量达到最大值33.08 g/L，比出发菌提高了28.62%；转化率达37.56%，提高了22.87%；副产物AC 11.59 g/L，降低了20.01%；2，3-BD/AC比率为2.854，提高了60.79%。过量表达ACR，并且控制发酵条件在弱酸性，促进了由AC到2，3-BD的转化程度，成功地使主产物2，3-BD的产量提高，同时降低了副产物AC的积累。

图6　发酵过程中AC和2，3-BD曲线Fig.6　Curves of AC and 2，3-BD during the fermentation

表3　发酵特征分析Table 3　Analysis of fermentation results

2.5过量表达ACR对有机酸积累的影响

对B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr两株菌发酵液进行有机酸测定分析，结果如表4所示，相比出发菌，重组菌株发酵液中副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸分别降低了15.21%、34.35%、35.39%、39.53%。ACR的活力和NADH的含量是2，3-BD合成的两个重要因素，过量表达ACR，促进了从AC到2，3-BD的合成效率。获得了更多2，3-BD就意味着有更多的NADH参与了AC向2，3-BD的转化，也就是说该过程需要消耗更多的NADH，而用于需要NADH参与的其他有机酸副产物的NADH的量会相应减少，这可能是相关支路的有机酸积累量减少的原因所在。

表4　ACR过量表达对发酵过程有机酸质量浓度的影响Table 4　Effects of overexpressing ACR on organic acidsin fermentation

3　结语

以安全菌株B.subtilis 168为出发菌，克隆其乙偶姻还原酶基因acr，构建重组质粒pMA5-acr，将重组质粒转化入B.subtilis 168，构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/pMA5-acr。测定了重组菌ACR的酶活，并在弱酸性条件下进行发酵试验。结果表明，ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中实现了过量表达，主产物2，3-BD的产量得到提高，而副产物AC和相关有机酸的积累量则不同程度下降。2，3-BD高产菌株主要是克雷伯氏菌、产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌［3，9-10］，然而这些菌株都具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求。而枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，不产内毒素和致热敏蛋白质，是一种公认安全的微生物，无论是作为出发菌还是宿主菌都具有很强可行性［17］。过量表达ACR和适当控制发酵pH，增强了合成2，3-BD的碳源通量，消耗了更多的辅酶NADH。相应地，AC和需要NADH参与的相关有机酸合成所需的碳源流量和NADH则会减少，因而成功地实现了主产物2，3-BD产量提高和相关副产物产量减少的目标。虽然重组菌产2，3-BD的产量和国内外最高产量还有一定的差距［1］，但是相信通过进一步的分子改造和发酵条件优化，一定能实现微生物法高效安全生产2，3-BD的目标。

［1］Ji X J，Huang H.Microbial 2，3-butanediol production：a state-of-the-art review［J］.Biotechnology Advances，2011，29（3）：351.

［2］Garg S K，Jain A.Fermentative production of 2，3-butanediol：A review［J］.Bioresource Technology，1995，51：103-109.

［3］Syu M J.Biological production of 2，3-butanediol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55（1）：10-18.

［4］Jarboe L R，Zhang X，Wang X，et al.Metabolic engineering for enzymes in Clostridium［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010：761042.

［5］付晶，王萌，刘维喜，等.生物法制备2，3-丁二醇的最新进展［J］.化学进展，2012，24（11）：2268-2276. FU Jing，WANG Meng，LIU Weixi，et al.Latest advances of microbial production of 2，3-Butanediol［J］.Progress in Chemistry，2012，24（11）：2268-2276.（in Chinese）

［6］Magee R，Kosaric N.The microbial production of 2，3-butanediol［J］.Advances in Applied Microbiology，1987，32：89-161.

［7］Long S K，Patrick R.Microbial production of 2，3-Butylene glycol from cheese whey［J］.Applied and Environment Microbiology，1982，43（5）：1216-1218.

［8］Fulmer E I，Christensen L M，Kendali A R J.Production of 2，3-Butylene glycol by fermentation［J］.Industrial and Engineering Chemistry，1933，25：798-800.

［9］Celinska E，Grajek W.Biotechnological production of 2，3-butanediol-current state and prospects［J］.Biotechnology Advances，2009，27：715-725.

［10］Garg S K，Jain A.Fermentative production of 2，3-butanediol：a review［J］.Bioresource Technology，1995：103-109.

［11］Maddox I S.Microbial production of 2，3-butanediol［J］.VCH Verlagsgesellschaft mbH，1996：269-291.

［12］Larsen S H，Stormer F C.Diacetyl（acetoin）reductase from Aerobacter aerogenes Kinetic mechanism and regulation by acetate of the reversible reduction of acetoin to 2，3-butanediol［J］.European Journal of Biochemistry，1973，34（1）：100-106.

［13］Machielsen R，Uria A R，Kengen S W M，et al.Production and characterization of a thermostable alcohol dehydrogenase that belongs to the aldo-keto reductase superfamily［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，62：233-238.

［14］Wang Z，Song Q，Yu M，et al.Characterization of stereospecific acetoin（diacetyl）reductase from Rhodococcus erythropolis WZ010 and its application for the synthesis of（2S，3S）-2，3-butanediol［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2013：1.

［15］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，5259：680.

［16］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

［17］李静静，徐美娟，张显，等.一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达［J］.食品与生物技术学报，2013，32（5）：522. LI Jingjing，XU Meijuan，ZHANG Xian，et al.High-Level expression of Cold-Adapted α-acetolactate decarboxylase in Bacillus subtilis［J］.Jouranl of Food Science and Biotechnology，2013，32（5）：522.（in Chinese）

Improved 2,3-Butanediol Production by Overexpressing Acetoin Reductase in Bacillus subtilis 168

LI Xiupeng1，YANG Taowei2，XU Meijuan3，ZHANG Xian4，RAO Zhiming*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Bacillus subtilis 168 is a safe strain for industrial-scale microbial production of 2，3-butanediol（2，3-BD）.However，a large quantity of by-product of acetoin（AC）is accumulated during 2，3-BD fermentation process.Acetoin reductase（ACR）is the key enzyme which catalyzes the conversion of acetoin to 2，3-BD.In this study，in order to improve 2，3-BD production，we firstly cloned the acr gene of acetoin reductase into B.subtilis 168，and then further constructed the recombinant strain B.subtilis 168/pMA5-acr.The results showed that the yield and conversion rate of the 2，3-BD were increased up to 28.62%and 22.87%by the recombinant strain，respectively. Whereas the accumulation of the main by-product of acetoin decreased by 20.01%.Furthermore，the molar yields of by-products of formic acid，acetic acid，lactic acid，and succinate were also decreased.

Acetoin reductase，2，3-Butanediol，Acetoin，B.subtilis 168

Q 78

A

1673—1689（2016）03—0252—06

2014-11-26

国家973计划项目（2012CB725202）；国家自然科学基金项目（31400082，21276110）；教育部重点科研项目（113033A）；江苏高校优势学科建设工程资助和111引智工程项目（111-2-06）。

饶志明（1975—），男，江西临川人，农学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物育种和发酵代谢方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn