镍变应性接触性皮炎小鼠动物模型建立

魏若尧，孙井江，李　挚，刘跃华，高　虹，孙劲旅

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京100021)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：142- 148

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis)是一种以半抗原-特应性T细胞介导、由过敏原接触皮肤后激发产生的迟发型超敏反应性疾病(Ⅳ型超敏反应疾病)，以抗原刺激后局部皮肤出现一系列的炎症细胞浸润、炎症介质释放为主要特征，据文献报道，变应性接触性皮炎的炎症反应涉及许多不同的通路和免疫机制，包括大量不同的细胞类型、细胞因子、趋化因子和受体，还涉及局部和系统免疫反应，并同时覆盖了固有免疫系统和自身免疫系统。在致敏阶段，其主要参与细胞为肥大细胞及T细胞，初始T细胞在分化过程中分泌干扰素(interferon，INF)-γ和白细胞介素(interleukin,IL)- 4等细胞因子，同时反馈于T细胞促进分化；在激发阶段，除了T细胞的再次活化，固有免疫系统、B细胞、自然杀伤T细胞(natural killer T，NKT)、自然杀伤细胞(natural killer，NK)和调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)分泌的IL- 4、IL- 10等多种细胞因子也会参与并调控整个致敏过程。

变应性接触性皮炎可严重影响患者的生活质量[1- 2]。众多研究表明：金属镍无论是在我国还是全球范围，都是诱发变应性接触性皮炎产生的重要化学物质之一[3- 4]，进一步阐明镍变应性接触性皮炎的发病机制成为目前亟待解决的重要问题。动物模型是研究疾病发病机制，评价治疗药物的必不可少的实验工具，现在迫切需要建立与临床发病进程与表现相一致的动物模型用于发病机制的研究。本研究利用不同浓度的硫酸镍为变应原，建立小鼠急性变应性接触性皮炎模型，为临床前评价镍变应性接触性皮炎治疗药物提供动物模型。

材料与方法

试剂和仪器

六水合硫酸镍(分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：1209191)；10%中性福尔马林(北京益利精细化学品有限公司)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；小鼠IL- 4、小鼠IL- 10和小鼠INF-γ酶联免疫吸附试剂盒(abcam，96T)；DM1000显微镜(Leica)；Si(Li)固体探测器和谱仪分析系统。

实验动物

SPF级C57BL/6小鼠30只，雄性，体质量18～22 g。动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012- 0001]。饲养于无特定病原体动物(specific pathogen free，SPF)级环境中，动物设施许可证号[SYXK(京)2014- 002]。

动物分组及致敏方法

小鼠分为5组，每组6只。分别为5%- 5%硫酸镍组、10%- 10%硫酸镍组、10%硫酸镍单次刺激组、2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)为阳性对照组(positive control,PC)、0.9%氯化钠溶液(normal saline，NS)为阴性对照组(negative control,NC)。实验前24 h，小鼠右侧腹部固定部位(1.5 cm×1.5 cm)剃毛；实验第0天，于小鼠右侧腹部脱毛处封闭涂致敏受试物进行诱导致敏一次；实验第2天和第3天，于同一固定脱毛部位封闭涂抹激发受试物进行激发，各激发一次。10%- 10%硫酸镍单次刺激组于第0天、第3天涂抹生理盐水，仅在第2天涂抹硫酸镍进行刺激。

湿疹面积及严重度指数评分法

采用湿疹面积及严重度指数(eczema area and severity index, EASI)评分法，根据不同部位皮损症状严重程度，所占面积大小的综合积分，具体的计算方法如下[5]。临床症状的评分：临床表现分为四项，即：红斑(erythema，E)，硬肿(水肿)/丘疹[induration(edema)/papulation，I]，表皮剥脱(excoriation，Ex)，苔藓化(lichenification，L)。每一临床表现的严重度以0～3分计分，0=无，1=轻，2=中，3=重。各种症状分值之间可记半级分，即0.5。

皮肤超声检测

于激发后48 h，0.2%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，对激发部位皮肤进行超声扫描，并记录表皮厚度变化。

组织病理学检查

于激发后48 h剪取激发部位皮肤，10%中性福尔马林固定，进行组织修块，再固定，制作石蜡切片，苏木精-伊红染剂(hematoxylin and eosin stain，HE)染色，于光学显微镜下观察皮肤的形态学变化。

细胞因子检测

皮损组织IFN-γ、IL- 4和IL- 10的测定：分别采集5%- 5%硫酸镍组、10%- 10%硫酸镍组、10%硫酸镍单次刺激组和阴性对照组第一次激发后48 h后皮损部位的皮肤组织，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗去血污，滤纸拭干，剔除附属的结缔组织，称取200 mg 组织块，剪成小块后放入匀浆管中，加入2 ml PBS溶液中制成匀浆。组织处理过程均在冰上进行。将组织匀浆于4 ℃ 12 000 r/min，离心机半径为3 cm，离心20 min取上清备用。采用酶联免疫吸附试剂盒说明书要求测定，并使用专业软件Curve Expert1.3制作标准曲线，按标准曲线换算样品中待测细胞因子浓度。

统计学处理

结　　果

激发部位炎症反应

硫酸镍激发后，各组小鼠皮肤均出现不同程度的炎症反应(图1)。各组小鼠均为第一次激发后24 h后皮肤EASI分值最大，之后炎症反应逐渐降低。EASI平均分均值为：10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组>10%硫酸镍单次刺激组。在每个时间点上，10%- 10%硫酸镍组与阴性对照组之间均存在统计学差异(P<0.05)，与阳性对照组之间不存在统计学差异(图2)。

皮肤超声检测结果

激发后48 h实验组小鼠较阴性对照组小鼠表皮厚度均有增加，表皮厚度平均值：10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组>10%单次激发组。10%单次刺激组较阴性对照组表皮增厚不明显(图3、4)。

组织病理学结果

激发后48 h，硫酸镍各组小鼠激发部位皮肤均表现为真皮浅中层水肿，棘层肥厚，基底层液化变性，炎性细胞浸润，与人类急性炎症症状一致。其中10%- 10%硫酸镍组更为严重(图5)，10%硫酸镍单次刺激组仅表现为部分表皮增厚，未出现炎症症状。

激发部位细胞因子变化

小鼠第一次激发后48 h内，各实验组皮损部位皮肤组织IFN-γ、IL- 4和IL- 10的水平均发生变化。各组INF-γ、IL- 4和IL- 10均值水平为10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组>10%硫酸镍单次刺激组>阴性对照组。其中，10%- 10%硫酸镍组的IL- 4均值水平与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

图1小鼠镍变应性皮炎模型各组24 h时间点皮肤反应

Fig1Inflammatory reaction of NiSO4treated skin in experiment and control groups

图2　小鼠镍变应性皮炎模型不同时相皮肤炎症反应(EASI评分)Fig 2　Value of EASI for NiSO4 treated skin in experiment and control groups

图3　小鼠镍激发48 h后各组表皮厚度Fig 3　Thickness of epidermis for NiSO4 treated skin in experiment and control groups

图4小鼠镍激发48 h后皮肤超声图片

Fig4Picture for NiSO4treated skin in experiment and control groups

图5镍变应性皮炎小鼠模型腹部皮肤病理(HE染色×100)

Fig5Histopathology of nickel-treated skin on experimental group(HE×100)

分组干扰素⁃γ白细胞介素⁃4　白细胞介素⁃105%⁃5%硫酸镍组12168±6839818±43814787±864310%⁃10%硫酸镍组18455±100071486±139∗26744±555910%硫酸镍单次刺激组6809±　697338±02112079±869阴性对照组4686±2769219±12411195±6992阳性对照组9441±3457924±19914469±7412

*与阴性对照组比较，P<0.05

讨　　论

变应性接触性皮炎是目前世界上职业性皮肤病的最大难题之一，据统计约占职业性疾病发病率的20%[6]，这种职业性的接触性过敏不仅存在于产业工人中，也常见于医护人员、银行职员中[7]，在中国变应性接触性皮炎的发病率也呈逐年上升趋势[8]。变应性接触性皮炎的临床特点在发病初期为红斑、丘疹和水疱，随后可能会出现脱皮和皮肤干燥，常自觉剧烈瘙痒、烧灼或肿胀感，多有糜烂渗出或结痂，易反复发作，可严重影响患者的生活质量。变应性接触性皮炎的炎症反应涉及许多不同的通路和免疫机制，包括大量不同的细胞类型、细胞因子、趋化因子和受体，还涉及局部和系统免疫反应，并同时覆盖了固有免疫系统和自身免疫系统。这使得接触性超敏反应模型为许多机制的研究提供了合适的研究模型。

在本实验中，5%- 5%、10%- 10%硫酸镍组在激发后皮肤均出现红斑反应，而10%硫酸镍单次刺激组仅出现轻度表皮粗糙，并未产生严重的红斑反应。根据红斑分级评分，实验组红斑指数为10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组。其中，10%- 10%硫酸镍组与阴性对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，与阳性对照组之间差异不存在统计学意义。而10%单次刺激组红斑反应不明显，与阴性对照组无统计学差异。第一次激发后48 h，5%- 5%硫酸镍组和10%- 10%硫酸镍组小鼠激发部位皮肤均表现为真皮浅中层水肿，棘层肥厚，基底层液化变性，其中5%- 5%硫酸镍组出现少量炎性细胞浸润，10%- 10%硫酸镍组炎性细胞浸润更为严重。两组病理表现与人类急性炎症症状一致。10%- 10%硫酸镍单次刺激组仅表现为部分表皮增厚，未出现炎症症状。通过超声扫描， 实验组小鼠较阴性对照组小鼠表皮厚度均有增加，表皮厚度平均值为：10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组>10%单次激发组。10%单次刺激组较阴性对照组表皮增厚不明显。同时，各硫酸镍实验组皮损部位皮肤组织IFN-γ、IL- 4和IL- 10水平发生变化。各组IFN-γ、IL- 4和IL- 10均值水平为10%- 10%硫酸镍组>5%- 5%硫酸镍组>10%硫酸镍单次刺激组>阴性对照组。其中，10%- 10%硫酸镍组的IL- 4与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。10%单次刺激组各细胞因子检测均值与阴性对照比较差异无统计学意义(P>0.05)。综上所述，对大体反应、病理变化、超声扫描和细胞因子进行综合分析，5%- 5%、10%- 10%硫酸镍刺激组成功诱发小鼠镍接触性皮炎，10%- 10%硫酸镍组皮肤炎症更为严重。而10%单次刺激组与阴性对照组无统计学差异，提示并未产生小鼠刺激性皮炎，说明本实验5%- 5%、10%- 10%硫酸镍组诱导出的是过敏性接触性皮炎，小鼠镍接触性皮炎模型建立成功。

现阶段动物模型包括人工诱导模型和自发性疾病模型。此前接触性皮炎的研究多用反复暴露于2,4-二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型，这种接触敏感性的半抗原会造成缓发型变应性接触性皮炎[9]。在1995年，Kitagaki 等[10]人报道表皮重复接触另一种接触敏感性半抗原：2,4,6-硝基氯代苯(trinitrochlorobenzene，TNCB)引起的皮炎反应由迟发型转变为了速发型。这一类的模型操作方便，可以为人类的特应性皮炎的研究提供模型。本实验也用此模型作为阳性对照实验。此前，小鼠镍致敏性模型大都采用皮下注射致敏物的方式，不便操作且与临床致病方式存在差异。Maruyama等[11]在2003年建立的小鼠镍过敏模型，在2010年由Johansen等[12]证明是由镍盐的刺激性而非致敏性引起的，即此小鼠模型并非真正的Ⅳ型接触性皮炎。在本实验中，按照预先实验，首次采用与人类接触变应原相同的途径进行涂抹致敏和激发，建立了一种与人类发病进程相同的主动致敏的小鼠镍变应性接触性皮炎动物模型，为研究镍致敏性皮炎的临床发病进程、临床表现及整个免疫机制的研究提供了重要的工具。

有文献表明脂多糖会增加由镍引起的反应[13- 14]，最近又有研究表明，由于小鼠的Toll样受体4(Toll-like receptors，TLR- 4)受体缺少在人类中发现的镍结合组氨酸[15]，因此，小鼠中的镍过敏只有在和其他刺激物或者辅助作用下才会发生。然而，Vennegaard等[15]分别在TLR- 4完整的和TLR- 4缺失的C3H/HeN小鼠上进行实验，结果显示脂多糖不应答，而C3H/HeJ小鼠排除了镍致敏应答是由于脂多糖污染，以上研究表明，至少在小鼠中，镍致敏是由于固有免疫中其他机制引起的，并不是通过TLR- 4受体。同时，也说明了镍致敏反应对于小鼠MyD88的依赖性。因为在人类皮肤暴露于镍之后，镍元素主要集中在表皮中，而TLR- 4受体通常不在人类皮肤细胞中表达。综上所述，这些研究可以解释笔者能够在非脂多糖暴露的情况下，建立了变应性接触性皮炎急性小鼠模型。

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