木犀草素对巨噬细胞炎症极化的影响及机制

王书侠，姚孝明，葛亮，吉宁，蒋叶，曹萌

严重病原感染导致的脓毒症病情危急，发展迅速，部分将发展为多脏器功能衰竭，甚至危及生命。此过程往往伴随重度炎症反应的发生，过度的炎症反应又会造成病理损伤，因此炎症的精确调控至关重要。巨噬细胞是触发炎症反应的重要免疫细胞，根据所处微环境不同，可被诱导分化为致炎型(M1)巨噬细胞或抗炎型(M2)巨噬细胞[1]。巨噬细胞的不同极化方式，决定了该细胞在炎症的发生、发展和维持机体稳态等方面所发挥的重要作用[2]。调控脓毒症时巨噬细胞的极化对控制疾病的转归具有十分重要的意义。木犀草素(luteolin, lut，L)属于天然黄酮类化合物，主要存在于蔬果和中草药中，具有很强的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗感染、免疫调理、保护心脏等[3-5]。有研究表明，木犀草素能显著减轻活化的巨噬细胞的炎性反应，下调白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等致炎因子的表达，但木犀草素是否影响巨噬细胞的炎症极化，目前还未见报道[6]。本研究通过脂多糖(LPS)联合γ-干扰素(IFN-γ)刺激小鼠RAW264.7细胞，研究木犀草素对其炎症分子的表达及极化表型的影响，以探讨木犀草素调节巨噬细胞极化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 RAW264.7巨噬细胞来源于小鼠腹腔，为南京中医药大学惠赠；LPS、MTT和木犀草素购自美国Sigma公司；IL-4购自美国PeproTech公司；抗体磷酸化信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transduction，p-STAT)3和p-STAT6购自美国CST公司；IFN-γ购自美国R&D公司；β-actin一抗购自美国Santa Cruz公司；Antimouse CD86 FITC、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Toyobo公司。流式细胞仪购自Millipore公司；Quant studio DX realtime-qPCR仪购自美国Applied Biosystemsby Life Technologies公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞培养及诱导 RAW264.7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2、37℃的孵箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。10ng/ml LPS和20ng/ml IFN-γ刺激诱导其致炎型M1极化；20ng/ml的IL-4刺激诱导抗炎型M2极化。

1.3 MTT实验检测细胞活力 取对数期生长的细胞制备单细胞悬液，铺96孔板后过夜培养。采用LPS和IFN-γ刺激细胞诱导M1型极化，IL-4刺激诱导M2型极化，同时M1细胞用终浓度为5、10、20、40、80μmol/L的木犀草素处理，24h后，每孔加MTT(5g/L，PBS)20μl，4h后吸弃上清，每孔加DMSO 150μl，待结晶物完全溶解后，测定吸光度(OD值)，计算生长率。生长率＝(实验组OD值/对照组OD值)×100%。根据MTT实验结果确定后续实验浓度。

1.4 实验分组 根据MTT结果将实验分为6组。对照组(control组)：不加药物；M1组：采用LPS和IFN-γ刺激；M2组：采用IL-4刺激；M1+5L组、M1+10L组和M1+20L组在加LPS和IFN-γ的基础上分别再加终浓度为5、10、20μmol/L的木犀草素。24h后收集细胞。

1.5 实时定量PCR(real-time qPCR)检测M1和M2型标志分子mRNA水平 检测细胞的处理法同上，细胞处理后过夜，收集细胞，按照试剂盒说明书，Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，荧光定量PCR扩增一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-6、精氨酸酶1(Arginase 1，Arg1)、CD206、CD163等基因，以GAPDH为内参照，目的基因相对表达量采用2–ΔΔCt法。

1.6 Western blotting检测蛋白表达 冷的PBS洗涤细胞，放射免疫沉淀法(RIPA)并加入蛋白酶抑制剂(PMSF)裂解提取总蛋白，参照BCA试剂盒说明书进行蛋白定量。20μg蛋白煮沸后SDS-PAGE电泳，转膜，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2h。加入一抗4℃过夜，洗膜3次，加入二抗，室温摇床2h，洗膜4次，ECL显影，扫描胶片并保存。用Quantity One软件分析灰度值，以β-actin为内参照，并计算与β-actin的比值。

1.7 ELISA检测上清细胞因子含量 细胞按每孔2×105个/ml的密度铺板，过夜培养后，LPS和IFN-γ或IL-4诱导极化。然后加入不同剂量的木犀草素，实验分组同1.4。24h后，收集上清，检测IL-6和TNF-α的水平，具体操作依据ELISA试剂盒检测说明书。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。计量资料采用表示，多组间比较采用单因素方差分析和Tukey post-hoc检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 木犀草素对细胞活力的影响 MTT结果显示，M2组细胞的相对活性(95.75±3.16)与对照组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。M1组细胞活性(72.24±5.10)与对照组比较明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。当木犀草素浓度达到40μmol/L时，细胞活性(42.78±4.61)开始降低，与M1组(72.24±5.10)比较，差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。故本实验选择木犀草素5、10和20μmol/L作为后续实验的浓度。

图1 木犀草素对活化的 RAW264.7细胞活力的影响Fig.1 Effects of luteolin on the vitality of activated RAW264.7 macrophages

2.2 木犀草素对M1和M2型标志分子表达的影响从qPCR结果可见，LPS和IFN-γ刺激RAW264.7细胞导致M1型标志分子iNOS、IL-1β和IL-6的相对表达明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01；P＜0.001，表1)，表明诱导其向M1型极化。IL-4刺激RAW264.7细胞导致M2型标志分子Arg1、CD206和CD163的相对表达明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05；P＜0.01)，表明诱导其向M2型极化。5、10、20μmol/L的木犀草素干预M1细胞后，M1型炎性因子的表达明显下调，与M1组比较差异有统计学意义(P＜0.05；P＜0.01)；而木犀草素处理后的M2型标志分子的表达明显上调，且呈浓度依赖性，与M1组比较差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 木犀草素对M1型标志分子iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA相对表达的影响(±s，n=3)Tab.1 Effects of luteolin on the relative expressions of M1 marker molecules iNOS, IL-1β and IL-6 mRNA (±s, n=3)

表1 木犀草素对M1型标志分子iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA相对表达的影响(±s，n=3)Tab.1 Effects of luteolin on the relative expressions of M1 marker molecules iNOS, IL-1β and IL-6 mRNA (±s, n=3)

iNOS.Inducible nitric oxide synthase; IL.Interleukin; (1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.001 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with M1 group; (4)P＜0.01 compared with M1 group

Group iNOS IL-1β IL-6 Control 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 M1 98.91±10.65(1) 110.69±4.12(1) 394.10±33.47(2)M2 0.54±0.08 2.13±0.35 1.99±0.07 M1+5L 95.45±1.64(3) 103.14±2.58(3) 177.51±19.28(3)M1+10L 92.73±16.96(3) 78.38±8.65(3) 106.14±5.63(3)M1+20L 29.52±3.07(3) 41.59±6.80(3) 27.15±1.26(4)

表2 木犀草素对M2型标志分子Arg1、CD206和CD163 mRNA相对表达的影响(±s，n=3)Tab.2 Effects of luteolin on the relative expressions of M2 marker molecules Arg1, CD206 and CD163mRNA (±s, n=3)

表2 木犀草素对M2型标志分子Arg1、CD206和CD163 mRNA相对表达的影响(±s，n=3)Tab.2 Effects of luteolin on the relative expressions of M2 marker molecules Arg1, CD206 and CD163mRNA (±s, n=3)

Arg1.Arginase 1; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with M1 group

Group Arg1 CD206 CD163 Control 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 M1 1.61±0.50 0.68±0.19 0.41±0.14 M2 16.72±2.51(2) 6.13±0.09(1) 3.79±0.77(1)M1+5L 3.22±1.44(3) 1.21±0.44(3) 0.62±0.39(3)M1+10L 4.99±0.99(3) 1.70±0.53(3) 1.38±0.40(3)M1+20L 7.63±2.33(3) 4.23±1.71(3) 2.06±0.12(3)

2.3 木犀草素对极化的细胞表面分化群CD86的影响 流式细胞术结果显示，LPS和IFN-γ诱导成的M1细胞表面分化群CD86的平均荧光强度(127.23%)增强，表明CD86的表达上调，相对于对照组(27.6%)，峰明显右移。而IL-4诱导成的M2细胞CD86的平均荧光强度(26.18%)减弱，表明CD86的表达下调，峰左移，与对照组的曲线几乎重叠。在加入不同浓度的木犀草素后，M1细胞表达的CD86的荧光强度逐渐减弱，在木犀草素浓度为20μmol/L时，CD86的荧光强度低至44.38%，较木犀草素浓度为10μmol/L时的72.23%明显下降，峰明显左移(图2)。

图2 木犀草素对极化的细胞CD86表达的影响Fig.2 Effects of luteolin on CD86 expression in polarized cells

2.4 木犀草素对活化的细胞分泌炎症因子的影响M1组细胞分泌的IL-6和TNF-α与对照组比较明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。经木犀草素处理后，细胞因子的分泌减少，与M1组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。M2组细胞分泌的IL-6和TNF-α与M1组比较明显下调，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.001)，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表3)。

表3 木犀草素对活化的细胞IL-6和TNF-α分泌的影响(pg/ml, ±s, n=3)Tab.3 Effects of luteolin on IL-6 and TNF-α secretion in activated cells (pg/ml, ±s, n=3)

表3 木犀草素对活化的细胞IL-6和TNF-α分泌的影响(pg/ml, ±s, n=3)Tab.3 Effects of luteolin on IL-6 and TNF-α secretion in activated cells (pg/ml, ±s, n=3)

IL.Interleukin; TNF-α.Tumor necrosis factor-α; (1)P＜0.001,(2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.001, (4)P＜0.01, (5)P＜0.05 compared with M1 group

Group IL-6 TNF-α Control 35.21±5.00 320.12±28.28 M1 3203.33±221.04(1) 2004.25±39.59(2)M2 68.34±2.83(3) 348.16±42.22(4)M1+5L 2257.61±61.38(5) 1608.02±22.63(5)M1+10L 516.63±18.78(4) 78.38±8.65(5)M1+20L 87.26±8.46(3) 366.20±36.66(4)

2.5 木犀草素诱导巨噬细胞源性M1表型向M2表型极化的机制 STAT信号通路的活化参与巨噬细胞极化表型的调控。LPS和IFN-γ诱导RAW264.7细胞M1极化，p-STAT3上调、p-STAT6下调。而IL-4诱导的细胞M2极化，p-STAT6上调、p-STAT3下调。木犀草素处理后，M1源性的p-STAT3逐渐下调，而p-STAT6逐渐上调，并具有浓度依赖性(图3)。

图3 木犀草素对活化的细胞p-STAT蛋白表达的影响Fig.3 Effects of luteolin on p-STAT protein expression in activated macrophages

3 讨 论

脓毒症时活化的巨噬细胞分泌大量的致炎因子，过量的致炎因子打乱了机体的稳态平衡，引起一些炎症相关疾病，如肿瘤、感染、肾病、动脉粥样硬化、2型糖尿病等[7-9]。鉴于巨噬细胞感知微环境的不同而极化为不同的表型，即在LPS等因子的刺激下分化成致炎症损伤的M1型和在IL-4或IL-13等诱导下参与炎症修复的M2型，如M1型活化，则损伤占优势，炎症加重；如M2型活化，则抗炎和组织修复反应为主导，则炎症趋向好转。因此调控巨噬细胞功能表型对治疗炎症性疾病具有非常重要意义。本研究通过黄酮类化合物木犀草素对活化的小鼠RAW264.7炎症因子进行调节，探讨木犀草素对巨噬细胞极化的影响及可能的机制，为天然抗炎药的开发和利用奠定理论基础。

本研究发现，LPS联合IFN-γ诱导的RAW264.7细胞被活化致敏，形态发生明显变化，M1型炎症介质iNOS、IL-1β、IL-6等表达上调；IL-4诱导的M2型抗炎因子Arg1、CD206和CD163表达上调，表明巨噬细胞的炎症模型诱导成功。木犀草素处理后，M1极化的RAW264.7细胞表达的致炎因子下调，抗炎分子上调，同时M1细胞上清分泌的IL-6和TNF-α明显降低，说明木犀草素能抑制致炎因子的表达，促进抗炎分子的表达，诱导致炎型的M1细胞向抗炎型的M2细胞极化。

在巨噬细胞的极化过程中，涉及许多转录因子的调节，其中STATs的活化占有举足轻重的地位，活化的STAT3和STAT6参与多种致炎和抗炎因子的调控。Yu等[10]报道，白花前胡素可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6的表达和STAT3蛋白通路的激活，并且IL-6的表达与STAT3蛋白的活化相关。Chen等[11]发现，酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1)能通过下调STAT6而抑制M2表型的极化。条班紫菜糖蛋白能促进RAW264.7细胞从M1向M2的转化，这个过程有STAT3和STAT6通路的参与[12]，可见STAT3和STAT6的激活在M1型和M2型的表型极化过程中发挥举足轻重的作用。本研究发现LPS和IFN-γ诱导的M1极化细胞p-STAT3表达增强，致炎介质上调，IL-4诱导的M2极化细胞p-STAT6表达增强，抗炎介质下调。木犀草素处理后，M1极化的细胞p-STAT3水平明显减少，致炎因子下调，而p-STAT6的水平明显增多，抗炎因子上调，表明木犀草素调节RAW264.7细胞M2极化的过程是通过抑制p-STAT3、上调p-STAT6而实现的。

本研究中，我们以LPS和IFN-γ协同刺激RAW264.7细胞诱导M1极化，释放炎症介质IL-6、IL-1β和TNF-α等。IL-6和IL-1β为炎症早期的重要标志物，同时，IL-6还与自身免疫病及肿瘤的侵袭及耐药相关[13-14]。TNF-α在炎症的急性期大量产生，能引起发热反应。有研究表明，LPS不能直接活化STAT3，但M1细胞释放的IL-6和IFN-γ等能间接激活STAT3，活化的STAT3进一步诱导巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS等炎症因子的表达，这些因子之间形成严格的网络，导致致炎因子的异常分泌，引起组织坏死和脓毒性休克[15-16]。本研究表明，木犀草素有力地抑制了M1细胞p-STAT3的表达，调节致炎因子在合适的水平。

与STAT3不同，STAT6能刺激巨噬细胞向M2型极化，活化的STAT6可以调节抗炎因子的表达，如Arg1、CD206、CD63等，STAT6的缺失还会诱发自身免疫病[17-18]。Arg1可与iNOS竞争底物L-精氨酸，不仅能减少iNOS所生成的一氧化氮(NO)对机体的损伤，还能分解精氨酸促进组织的修复[19]。CD206和CD163，均为M2型细胞膜表面的标志分子，参与抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫调理等[20-22]。IL-4能通过STAT6的活化介导巨噬细胞M2型极化，上调抗炎因子的表达。本实验结果也证实IL-4诱导的巨噬细胞STAT6表达增强，同时，木犀草素处理的M1细胞STAT6表达增强，抗炎因子逐渐上调，表明木犀草素通过p-STAT6通路诱导M1细胞向M2型极化，释放抗炎因子，减轻炎症损伤。

木犀草素作为一种可食用的黄酮，存在于多种蔬果和中草药中，具有抗氧化、抗炎和清除自由基等作用。目前，抗炎免疫中药的机制研究多集中于抑制炎性介质的释放和核转录因子的活性等，寻找中药来源的巨噬细胞表型调控剂势在必行[23]。中药木犀草素为天然抗炎免疫药，具有多效调节、不良反应轻和易于耐受等特点[24]。我们的前期研究结果显示，木犀草素可以抑制活化的巨噬细胞炎症介质的释放，但木犀草素是否能调节巨噬细胞表型的极化还不明确[6]。本研究结果显示，木犀草素可明显抑制M1型巨噬细胞标志物的表达，促进M2型标志物的表达，调节致炎型M1巨噬细胞极化为抗炎抗损伤作用的M2型巨噬细胞，此功效可能是通过抑制p-STAT3、激活p-STAT6而实现的。上述木犀草素对巨噬细胞极化的影响及调控机制，将为临床治疗炎症相关性疾病提供新的思路。