环状RNA：生物合成、功能及其在心血管疾病中的作用

胡杨兮，油红敏，荆清

1 环状RNA研究概况

细胞中的RNA可以分为编码RNA和非编码RNA两种类型。其中非编码RNA占98%以上，可根据功能、长度和结构不同细分为转运RNA(transfer RNA，tRNA，74～95bp)、核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA，121～5000bp)、小核RNA(small nuclear RNA，snRNA，100～300bp)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA，100～300bp)、指导RNA(guide RNA，gRNA，55～70bp)、微小RNA(microRNA，miRNA或miR，19～23bp)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA，piRNA，24～30bp)、小干扰RNA(small interfering，siRNA，21～25bp)、长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA，＞200bp，线性)和环状RNA(circular RNA，circRNA，＞200bp，环状)[1]。

1976年，研究者首次从RNA病毒中检测到circRNA[2]，最初被认为是线性RNA错误剪接的产物[3]而没有引起研究者的注意。近年来，随着高通量测序技术的成熟及应用，circRNA被发现与多种人类疾病的发生发展有关，其生物学功能也逐渐被揭示。如circITGA7可通过吸收miR-370，抑制其对靶基因NF1表达的下调，从而抑制结直肠癌的生长和转移[4]。在胰腺癌组织中的研究发现，circ_0006215可通过海绵机制下调miR-378a的表达，解除其对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A4(serine proteinase inhibitor A4，SERPINA4)基因表达的抑制作用[5]。小鼠中circ_015947同样可以吸收miR-188、miR-329、miR-3057、miR-5098和miR-683，调控小鼠神经元的缺血-再灌注损伤过程[6]。众多研究表明，circRNA可以通过充当miRNA海绵、竞争性结合信使RNA(message RNA，mRNA)、与蛋白质结合形成复合体等调控基因表达[7]，在转录方面调控mRNA的剪接、翻译和降解，以及可以作为多种疾病的生物标志物等[7]。

circRNA分子的结构类似于一个封闭的环，不具有5'端帽子结构和3'端多腺苷酸尾部，因此不容易被核酸外切酶降解[8]。由于circRNA不具有多聚腺苷酸尾部，常规的RNA提取方法无法精确地对其进行提取，只有在提取总RNA后去除rRNA和具有多聚腺苷酸尾部的线性RNA才能大量富集circRNA[9]。随着生物技术的发展，现在人们广泛采用高通量测序和芯片分析方法大量而准确地检测circRNA。circRNA虽然表达丰度较低，但有时空特异性[10]。在人类心脏组织中，circRNA的表达多数与其同源mRNA相关[11]。有研究从钙化的人主动脉瓣标本中检测到5476个circRNA，其中1412个具有主动脉瓣特异性[12]。circRNA因结构稳定，平均半衰期甚至长达50h[13-15]，因此在追踪编码基因进行诊断时，相对于半衰期较短的线性mRNA而言，circRNA更具优势[16]。circRNA在外泌体中含量较丰富并可通过外泌体释放到外周血[16]。除外周血外，去除细胞的唾液中也已经检测到400多种circRNA，可用于无创诊断[17]。目前，已经建立了11个在线circRNA数据库[18]，包括BBBomics、circ2Traits、circBase、circInteractome、circNet、circRNADb、CSCD、exorBase、PlantcircBase、Soma-miR和TSCD，可为研究者提供便捷的circRNA及相关通路检索。通过对多种生物的circRNA表达谱进行研究，发现circRNA在进化上保守，性质稳定[19]，更显示出circRNA作为疾病诊断工具的优势。

2 circRNA的生物合成

生物体内大多数circRNA由线性前体RNA(premRNA)加工合成，这是通过多种非经典的反向剪接方式完成的。circRNA生物合成主要有3种模型[19](图1)。第1种被称为“套索驱动环化(lariat-driven circularization)”或“外显子跳跃(exon skipping)”模型，即在pre-mRNA合成过程中RNA被折叠，使得多个外显子互相靠近、“跳跃”形成环形的RNA中间体，继而通过套索样剪接生成circRNA。第2种模型被称为“内含子配对驱动环化(intron-pairingdriven circularization)”或“直接后拼接(direct back splicing)”模型。这一模型中，反向互补的ALU序列存在于外显子上下游的内含子之中[20]，其互相配对介导了反向剪接形成circRNA。多种多样的内含子和ALU序列使配对存在选择性和竞争性，导致同一个基因生成多种circRNA[20]，这一过程称为“可变环化”。近年来，研究发现还存在着第3种环化方式：当pre-RNA在某个外显子附近存在7nt富含鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)的序列(GU-rich sequence)，另一外显子附近存在11nt富含胞嘧啶(C)的序列(C-rich sequence)时，由剪接反应产生内含子套索的过程中，内含子可避开脱支反应，环化而形成稳定的circRNA[21]。

图1 circRNA生物合成途径Fig.1 The biogenesis of circRNAs

circRNA按组成成分可分成3类。完全由外显子构成的circRNA称为外显子circRNA(exonic circRNAs，EcircRNAs)，同时含有外显子和内含子者称为外显子-内含子circRNA(exonic-intronic circRNAs，EIcircRNAs)，完全由内含子构成者则称为ciRNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)[21]。根据circRNA的亲本基因位置，又可将其分为基因内(intragenic)circRNA和基因间(intergenic)circRNA[22]。每一个EcircRNA、EIcircRNA和ciRNA分子都源自同一个亲本基因内部的不同外显子和(或)内含子的拼接，因此都属于基因内circRNA；除此之外，来源于不同基因之间的基因组区间的circRNA则称为基因间circRNA[23]。

circRNA的合成受多种因素调控。多种RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)可促进环化过程，如RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ，RNA-polⅡ)[24]、Quaking蛋白(QKI protein)[10]、Muscleblind蛋白(MBL protein)[25]以及RNA结合基元蛋白20(RNA binding motif protein 20，RBM20)[26-27]等。作用于RNA的腺苷脱氨酶1(adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1，ADAR1)则可抑制circRNA的合成[28]。

3 circRNA的功能

3.1 调控miRNA circRNA含有大量被称为miRNA反应原件(miRNA response elements，MREs)[29]的miRNA结合位点，在细胞质中可抑制miRNA与其靶mRNA的结合，从而促进或抑制靶基因的表达。circRNA可以具有多个miRNA的MREs，还可以具有针对单个miRNA的多个结合位点[1]。这种对miRNA的吸收作用被形象地称为“miRNA海绵”作用[30]。经典的miR-7的circRNA海绵(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)，也称为miRNA海绵小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degenerationrelated protein 1 antisense，Cdr1as)可负性调节miR-7的表达[31]。Cdr1as含有超过70个miR-7结合位点，在HEK293细胞中高表达且在每个细胞中可以结合多达2万个miR-7分子[32]；同时可以结合阿尔戈蛋白(Argonaute proteins，AGO)，在脑[30]、胰岛[33]等组织吸收miR-7，抑制其对靶基因的负性调控作用。尽管海绵效应是circRNA介导基因调控的经典模型，但最近的一些研究表明，只有少数circRNA表现出miRNA海绵的特性，生理性circRNA表达变化对高表达的miRNA没有影响[34-35]。少数circRNAs，如CDR1as和cSRY，含有超过10个特定miRNA的结合位点，被视为“超级海绵”[36]。除了简单抑制外，circRNA与miRNA之间的相互作用还与miRNA的贮存、分选和定位有关[31]。

3.2 直接影响基因表达 circRNA可通过调控线性RNA转录和可变剪接直接参与基因表达的调控。如外显子跳跃模型中，前体RNA在环化形成ecircRNA的同时也可以进行可变剪接形成成熟的线性RNA，如此ecircRNA的合成会竞争性地阻碍同源的线性RNA的合成[37]，但也有增加circRNA自身或其相应线性RNA表达的报道[38]。另外，含有翻译起始位点的pre-mRNA如发生环化而非线性剪接，意味着circRNA的形成减少了mRNA的形成和下游蛋白的翻译，这种作用被称为“mRNA陷阱”[39]。

3.3 调控蛋白质功能 circRNA可以结合某些有关键作用的RNA结合蛋白，间接地调节基因表达[40]。既往研究业已报道多种circRNA可以结合蛋白因子如RNA-pol Ⅱ和AGO，作用于转录起始区域调控转录[21,31]。定位于核内的circRNA可以与RNApol Ⅱ相互作用于其亲本基因的启动子区域并调节亲本基因的转录[21,41]，这些circRNA包括EIcircRNA和ciRNA。比如circEIF3J和circPAIP2与小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs)U1结合形成EIciRNA-U1 snRNP复合物，然后该复合物可与位于其亲本基因启动子区域中的RNA-polⅡ相互作用，从而增强其亲本基因的转录[41-42]。ciRNA c-sirt7可与RNA-pol Ⅱ延伸复合体相互作用，导致其亲本基因锚蛋白重复域52(ankyrin repeat domain 52，ankrd52)及Sirtuin 7(SIRT7) mRNA明显下调[21]。剪切因子MBL相关circRNA(MBL-related circular RNA，circMbl)可以结合MBL，调控自身的生物合成，形成一种RNA转录的自身调节机制[25]。叉头盒O3相关circRNA(Forkhead box O3related circular RNA，circFoxo3)则能与周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinases 2，CDK2)蛋白和周期蛋白依赖性激酶P21(cyclin dependent kinase p21)蛋白结合形成复合体，调控周期蛋白A(cyclin A)和周期蛋白E(cyclin E)等，从而影响细胞周期[43]。除此之外，circFoxo3还有助于结合周期蛋白依赖性激酶P53(cyclin dependent kinase p53)蛋白和小鼠双微粒体(murine double minute 2，MDM2)蛋白，促进P53蛋白的降解[44]。分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation protein 1，ID-1)、转录因子E2F1、黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1α)蛋白与circFoxo3的相互作用也有报道[44]。

3.4 编码蛋白质 circRNA缺少编码RNA的一些主要共性特征，如5'端m7GPPPN帽子结构和3'端多聚腺苷酸尾巴结构，所以一直被认为属于非编码RNA。对脑心肌炎病毒的研究发现，circRNA中存在多个内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，RES)，提示circRNA也可能有编码蛋白的功能[45]。M6A修饰是最常见的RNA修饰，circRNA的m6A修饰能促进自身的翻译，首次证明了circRNA可以在外界刺激下表达蛋白质或多肽[46]。目前越来越多的circRNA表达蛋白被发现，比如：circ-ZNF609可以直接翻译蛋白参与肌肉的发生过程[47]；果蝇大脑中发现circRNA翻译生成的多种多肽和蛋白质[48]；circ-FBXW7编码的蛋白质约含185个氨基酸，可通过降低c-Myc蛋白的表达抑制胶质瘤的发生[49]。研究者认为这些circRNA的翻译主要在膜核糖体进行，且终止密码子在进化上保守[47-48]。circRNADb数据库(http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)更详细地揭示了内源性circRNA是否可以编码哺乳动物细胞中的功能性蛋白质的问题[50]。

3.5 其他功能 还有报道称circRNA与假基因生成有关[51]。假基因是结构上与通常的基因相似却无特定的生物学功能的基因，一般情况下不进行转录，也被称为“垃圾DNA”。假基因可通过DNA复制后因基因序列发生变化丧失蛋白质编码功能而产生，也可通过mRNA反转录为cDNA尔后插入基因组造成序列错乱而形成。研究人员分析了小鼠基因组中circRFWD2的相应环化位点(外显子6-外显子2)，相信至少存在33个circRFWD2衍生的假基因[51]。通常情况下，由反转录转座子LINE-1介导的反转录过程要求模板RNA存在多聚腺苷酸尾巴，而该研究发现与circRFWD2相关的假基因多数不存在多聚腺苷酸序列，说明circRFWD2可以通过某种未知的方式反转录为cDNA后整合到基因组中[52]。除circRFWD2之外，在小鼠基因组中发现的circSATB1，在某些细菌基因组中发现的circDIAP3和在人类基因组中发现的circPRKDC、circCAMSAP1都存在着衍生的假基因[52]，提示可能有更多circRNA通过反座过程改变基因组结构。

4 circRNA与心血管疾病

世界卫生组织(WHO)报告每年有近1750万人死于心血管疾病[53]，心血管疾病已经成为人类生命健康的重大威胁。非编码RNA在许多人类疾病的发生和发展过程中起着重要作用，circRNA也顺势成为心血管疾病及相关机制研究的热点[54]。目前circRNA与人类疾病相互关系的研究主要集中在肿瘤领域[55]，但也有越来越多的circRNA被发现在心血管疾病的发生发展中发挥作用(表1)。现阶段多数研究仍停留在动物模型阶段，但由于circRNA的保守性，动物模型与人类疾病很可能有相似的差异表达[56]。

4.1 circRNA与心肌病 心肌病是一组由于心室结构变化和心肌功能障碍导致心脏功能进行性下降的疾病，可分为肥厚型心肌病、扩张型心肌病和限制型心肌病等。心肌病可有心脏扩大、心律失常、血栓形成和心力衰竭等临床表现，病因多认为与病毒感染、免疫反应、遗传因素、药物中毒和心肌代谢异常等有关。研究发现circRNA在心肌病的发生发展过程中有着特殊的作用[1]。

表1 心血管疾病中circRNA的差异表达Tab.1 Differential expression of circRNAs in cardiovascular diseases

有研究显示，心脏相关的circRNA(heart-related circular RNA，HRCR)通过抑制miR-223活性，上调其靶基因编码的具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集结构域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)，对心脏肥大和心力衰竭的发生起保护性作用[74-75]，首次证实了circRNA参与心脏生理或病理过程的调节。

然而，更多研究者认为心肌细胞中circRNA常表现为一种负性调节的因素，其含量升高多提示心肌细胞生理功能的下降甚至死亡。有报道称在扩张型心肌病中RNA结合motif蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)依赖性的circRNA有差异表达[27]。慢性酒精性心肌病模型小鼠的心肌组织中发现多达265种circRNA的差异表达，多数与糖代谢紊乱有关[76]。

circRNA与心肌纤维化也有关系。心脏纤维化的特征在于细胞外基质的过度积累，导致正常心脏结构的损害和进行性心脏功能障碍[77]。circFoxo3可以阻止转录因子ID1、E2F1、FAK和HIF1α转入细胞核，从而抑制细胞的抗纤维化能力[78]。在用血管紧张素Ⅱ处理的糖尿病小鼠心肌细胞中，circRNA_000203和circRNA_010567的水平增高，二者可下调miR-26b-5p和miR-141，上调转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)基因的表达，继而导致心肌组织的相关蛋白质如胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、胶原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ，Col Ⅲ)和α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)的纤维化[66-67]。虽然人们对于circRNA与心肌纤维化之间的关系有了一定程度的认识，但均建立在体外实验基础上。因此，circRNA在心脏纤维化中的体内功能及其在心肌成纤维细胞分化中的作用有待进一步研究[79]。

4.2 circRNA与心肌梗死 circRNA在心肌梗死过程中也扮演着重要角色。心肌梗死是由于冠状动脉闭塞、血流中断，使相应灌注区域心肌因长时间缺血、缺氧而发生坏死的过程。因此，心肌梗死患者常可出现心功能不全、心律失常等并发症。circRNA Cdr1as是miR-7a“海绵”，在心肌梗死引起缺血时可抑制miR-7a表达，使其靶mRNA编码的刺激蛋白1(stimulatory protein 1，SP1)和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)翻译上调，加强对心肌的保护作用[33]。circRNA MFACR通过miRNA海绵作用抑制细胞质中的miR-652-3p，增强线粒体蛋白18(mitochondrial protein 18kD，MTP18)的翻译来促进线粒体分裂和心肌细胞死亡[80]，推测其可能是梗死后心肌细胞凋亡的潜在机制和治疗靶点。研究者检测了急性心肌梗死患者发病后3～4个月的血液样本，发现circRNA MICRA在心功能不全组(射血分数＜40%)的表达量高于心功能正常组(射血分数≥40%)，认为MICRA可用于急性心肌梗死的危险程度分级和心功能预后的早期判断[81]。对心肌梗死后心功能不全小鼠的左室心肌进行芯片检测结果提示，多种circRNA可主动响应应激，可作为心肌梗死后心功能不全的标志物[63]。对于尚未进展至心肌梗死的冠心病患者，有报道称circ_0124644在外周血中水平升高，可作为冠心病的潜在生物标志物[82]。另外，circRNA_081881在心肌梗死患者血浆中明显下降，而且它有7个miR-548的结合位点，据推测其可通过调节miR-548的表达进而调节过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的合成，并对多种细胞代谢具有调节功能[83]。

4.3 circRNA与高血压病 高血压病主要表现为体循环动脉血压升高，可伴有心、脑、肾等器官损害。高血压病是最常见的慢性病之一，也是心血管疾病最重要的危险因素。在高血压病患者中90%以上病因不明确，称原发性高血压病。circRNA是否与高血压病存在内在联系是值得深入思考的问题。

血管通过血管平滑肌的收缩和舒张维持血压的稳态，而血管平滑肌的功能依赖于多种蛋白质如α-SMA等。研究发现，circActa2可发挥miR-548f-59海绵功能，降低后者在血管平滑肌细胞中的水平，从而调节miR-548f-59对α-SMA mRNA的降解，增加α-SMA蛋白翻译并增强蛋白收缩能力，提示circActa2/miR-548f-59/α-SMA途径可能是原发性高血压的潜在分子机制[84]。另有一项纳入200例患者的病例对照研究发现，circ_0037911通过调节血肌酐水平促进原发性高血压病的发生和发展，并可作为原发性高血压病潜在的生物标志物[85]。研究发现，高血压病患者的血浆样本中circ_0005870水平明显升高，并通过下调miR-619、miR-1273g、miR-5095、miR-5096、miR-6807的表达，发挥相应的生物学功能，可作为高血压病诊断的全新生物标志物[58]。

肺动脉高压症也有相似的circRNA生物标志物。如近年来有报道称，circ_0002062和circ_0022342可作为肺动脉高压症的生物标志物[59]。对肺动脉高压小鼠的肺组织进行检测发现，circ_004592和circ_018351参考调控肺动脉高压的形成过程，可作为肺动脉高压症的潜在标志物和药物治疗靶点[60]。

4.4 circRNA与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是由动脉壁内皮下层的脂质沉积引发的，其特征是巨噬细胞、树突细胞和活化T细胞的炎性浸润[86]。在冠状动脉粥样硬化中，多种circRNA被报告为潜在的生物标志物，如存在于循环血中的多种circRNA[68,82]有利于冠状动脉粥样硬化性心脏病的筛查和早期诊断。研究发现，circRNA细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂4基因座中的反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin dependent kinase 4 locus，ANRIL)对涉及前rRNA加工和核糖体合成的pescadillo同系物1(pescadillo homologue 1，PES1)有调节作用，而抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞中PES1的表达可引起核仁应激和p53激活，促进细胞凋亡和动脉粥样硬化的发生发展[86]。利用注射维生素D3和喂食高脂饮食构建的动脉粥样硬化大鼠模型中，降低冠状动脉内皮细胞中ANRIL的表达可减少细胞凋亡和炎症因子的释放，预防冠状动脉粥样硬化[87]。动脉粥样硬化常累及含有平滑肌层的大、中动脉，引起这些动脉的管壁硬化、狭窄。前述circActa2/miR-548f-59/α-SMA途径中circActa2水平升高可正向调节α-SMA的数量和收缩功能，进而增强肌性动脉的收缩，导致高血压病和动脉硬化[84]。有研究用氧化型低密度脂蛋白处理脐静脉内皮细胞制作血管粥样硬化模型，发现沉默circ_0003575后增强了细胞增殖和血管生成能力，认为circ_0003575升高可能是血管损伤后动脉发生粥样硬化的关键[69]。

4.5 circRNA与心血管缺血再灌注损伤 由于压迫、栓塞、痉挛等各种原因引起的组织缺血既影响相应的灌流区域，又对血管本身的内皮细胞产生损伤。在体外缺氧条件下，脐静脉内皮细胞中circRNA cZNF292受缺氧调节，其高表达可对内皮细胞的缺氧损伤起保护作用，但cZNF292不具有miRNA结合位点，并非通过miRNA海绵机制而发挥作用[62]。高血压和冠状动脉粥样硬化患者的血浆中均可检测到circRNA cZNF609的差异表达。应用视网膜脉管系统研究circRNA在血管功能障碍中的作用，结果发现cZNF609在体内和体外低氧应激下明显上调；进一步研究显示，cZNF609沉默可增加内皮细胞的迁移和成管，对内皮细胞的氧化应激和缺氧应激都有保护作用，过表达反之，其机制是cZNF609充当内源性miR-615-5p海绵以抑制miR-615-5p的活性。因此通过人工干预减少cZNF609表达有望成为治疗血管内皮损伤后功能障碍的有效措施[88]。

4.6 circRNA与糖尿病血管病变 糖尿病是动脉粥样硬化的独立危险因素之一。在体外高糖环境培养的血管内皮细胞中检测到了1000多种新的circRNA和95种差异表达的circRNA，进一步研究表明，这些差异表达的circRNA调控磷酸化蛋白、转移酶和锌指蛋白的翻译，作为miRNA海绵调节糖代谢[73]，参与糖尿病血管病变。还有研究表明，高糖刺激下视网膜血管内皮细胞中circHIPK3含量明显上调，circHIPK3可充当内源性miR-30a-3p海绵，抑制miR-30a-3p的活性，并导致血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)、无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员2(winglesstype mouse mammary tumor virusintegration site family member 2，WNT2)和配体卷曲-4(frizzled-4，FZD4)蛋白的表达增加，提示circHIPK3通过阻断miR-30a而引起血管内皮增殖障碍[89]，参与糖尿病视网膜病变的发生。前述视网膜脉管系统的实验研究方法同样适用于高糖刺激的血管内皮细胞，结果发现沉默cZNF609同样可减轻高糖环境造成的血管内皮细胞功能障碍[88]。

有研究表明，高糖环境下人脐静脉内皮细胞中circ_0054633表达升高，而下调circRNA-0054633可促进高糖诱导的内皮细胞功能障碍，包括增殖、迁移和血管生成能力；而生物信息学分析显示，circRNA-0054633可能通过抑制miR-218的表达，降低其通过促进环形交叉轴突导向受体同源物1(roundabout1，ROBO1)和血红蛋白加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的合成来抑制高糖诱导的内皮细胞功能障碍，提示circRNA_0054633通过靶向ROBO1和HO-1而对高糖诱导的内皮细胞功能障碍发挥保护作用[90]。

4.7 circRNA与其他血管疾病 有研究对6例胸主动脉夹层患者的主动脉标本进行检测，并结合生物信息学分析预测circRNA_101238可能的靶miRNA为miR-320a，同时发现基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表达上调，而三者之间具体的调控机制尚不明确[70]。婴幼儿血管瘤是最常见的婴幼儿良性肿瘤之一。研究者在10名婴儿不同部位的血管瘤标本中检测出的circRNA中有234个表达上调和374个表达下调，并鉴定了其中circRNA_100933的上调和circRNA_100709的下调，然后通过生物信息学分析分别构建了含有100个和94个靶基因的circRNA/miRNA/mRNA网络，GO分析显示两个网络均参与了血管发生和发育过程[71]。

5 circRNA在心血管疾病中的作用研究现状

circRNA是新兴的研究热点，但是在心血管疾病领域发表的文献相对较少。据统计，目前Web of Science数据库收录的circRNA与心血管疾病相关的论文仅241篇，其中近5年发表了188篇，我国研究者贡献了101篇文献(图2)，我国在该领域发表的文献明显多于其他国家(图3)，说明我国是该研究领域的主要推动者。文献质量上，我国发表文献的总引用频次达1226次，平均引用12.14次，H指数(H-index)为17，即有17篇文献至少被引用17次。H指数是由美国物理学家乔治·赫希(Jorge Hirsch)在2005年提出的，用以量化某研究者或某一地区的研究成果[91]。由于H指数摒弃了传统的被引量，避免了自引等因素的影响，是用于评价文献质量的较客观的指标。可见，我国心血管疾病相关circRNA研究的数量和质量都处于世界前列，有较好的研究基础。但从整体上看，这一领域还有很大的探索空间，可以说circRNA与心血管疾病的相关研究才刚刚起步。

图2 与心血管疾病相关的circRNA研究论文发表情况Fig.2 The publication of articles on circRNA related to cardiovascular diseases

图3 各国发表的与心血管疾病相关的circRNA研究论文情况Fig.3 Articles on circRNA related to cardiovascular diseases published from different countries

6 总结与展望

有文献报道，神经系统疾病、肿瘤、糖尿病等多种疾病中circRNA的表达存在时空特异性，且具有一定功能，但其确切机制尚未完全明确[92-95]。其中，心血管疾病中也存在多种circRNA的差异表达，对circRNA及其功能的研究已成为当前心血管疾病基础研究的热点之一[78]。多个研究报道，circRNA在动脉粥样硬化[86]、心肌病[76]、心肌梗死[83]和高血压病[85]的发生发展中扮演着重要角色。此外，对快速心房起搏动物模型的研究发现了4种circRNA在实验组存在差异表达[96]，说明circRNA在房颤发病过程中也发挥着作用。但是circRNA与心律失常发生和发展的关系未见更多报道，需要更多的研究继续探索。另有报道称circRNA-284可以作为颈动脉斑块破裂的标志物，原因是circRNA-284的靶miRNA(miR-221和miR-222)与颈动脉斑块破裂密切相关[97]。显然在颈动脉斑块破裂潜在标志物的寻找和验证过程中，性质稳定的circRNA比miRNA更有优势。虽然当前circRNA作为心血管疾病标志物的相关报道还不多，但是circRNA-284的例子提供了一个思路，即是否可以尝试从已知的可作为心血管疾病标志物的miRNA入手寻找其上游circRNA作为新的标志物。随着越来越多的与心脏和血管相关的circRNA被发现，加之circRNA性质稳定，外周血circRNA的检测有助于心血管疾病的诊断和预后判断，而circRNA的调节是否能成为临床治疗新的突破口仍缺乏大规模临床试验数据的支撑[98]。而且，目前已知的许多circRNA被证实在体内有多种功能，用它们作为疾病标志物是否准确和特异，仍值得商榷[99]。在心血管疾病相关的circRNA中，有许多被发现可以启动蛋白质的合成过程，但这一作用是否自然存在于人体内仍是未知数[7]。

circRNA的临床应用仍有许多困难。其一，临床上缺乏统一的从生物样品中提取circRNA的方案。虽然实验室已经可以用多种方法分离、提纯特定的circRNA，但是实验试剂、检测仪器的多样性使其很难形成一个统一的标准化提取方案供临床检测使用[1]。其二，circRNA在外周血中含量很少，难以用临床常用的分光光度法进行定量。如前文所述，circRNA定量方法优选HTS和芯片检测，而对于临床上直接采集的样品，可行的方法是使用灵敏度高的定量PCR(qPCR)法，但是qPCR法有其先天不足：正因其极高的灵敏度，临床标本中经常会掺杂各种杂质而使得qPCR定量的准确性存疑[11]。

综上所述，人工合成的circRNA可能的作用机制有：①对已知的致病miRNA进行调控；②对已知有治疗作用的线性RNA进行环化以增强其抗RNA酶活性；③进行蛋白质或多肽翻译，在体内指导合成相应的生物活性药物；④通过作用于免疫系统调节免疫功能；⑤调控特定RBP活性；⑥直接调控转录和剪接机制；⑦在体调节治疗性circRNA表达等[56]。2012年，FDA批准lncRNA前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3)作为第一个非编码生物标志物用于临床常规诊断前列腺癌[100]。因此，我们认为，虽然circRNA仍有许多具体问题亟须解决，但是相信在不久的将来，人工合成circRNA作为一种药物治疗手段，一定有着广阔的应用前景。