姜黄素对活化肝星状细胞内脂质水平的影响及其机制

韩晓群，林剑国，杨婧

肝纤维化是因胶原纤维生成和溶解失衡造成的大量细胞外基质蛋白沉积在肝脏内形成瘢痕组织的过程。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纤维化的主要效应细胞，其活化是肝纤维化发生发展过程中的一个重要事件。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功能，并具有抗纤维化作用，目前对HSCs机制的研究主要集中在抑制HSCs增殖、诱导HSCs凋亡等方面[1-3]。本研究聚焦于姜黄素能否通过调节HSCs脂质水平抑制HSCs活化，从而发挥其抗纤维化作用机制，希望通过探讨姜黄素对活化HSCs脂质水平的影响及其可能机制，为临床抗纤维化治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 姜黄素、油红O染色试剂盒、TRI试剂购自美国Sigma公司；甘油三酯(triglyceride，TG)和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)ELISA试剂盒购于中生北控生物科技有限公司；高效RNA-cDNA 试剂盒购于美国Applied Biosystems公司；2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix购于上海欣百诺公司。

1.2 小鼠HSCs的分离、鉴定、培养及药物干预C57/B6小鼠购于武汉大学实验动物中心。向小鼠门静脉灌注链霉蛋白酶和胶原酶，采用梯度离心法分离HSCs。将分离所得HSCs以含20%胎牛血清(FBS)的DMEM悬浮，台盼蓝法计算细胞数及存活率。在倒置显微镜下观察，新分离的HSCs在培养液中悬浮，呈球形，折光性强。荧光显微镜下观察，新分离的HSCs在328nm紫外光激发下发出蓝绿色的自发荧光。细胞以1×106/cm2密度接种于6孔培养板，48h后纯度大于95%；3d后以含10% FBS的DMEM常规传代培养。取第4～9代细胞用于实验。同时常规培养小鼠肝细胞AML12，作为对照。实验前以不含FBS的DMEM培养HSCs或AML12细胞24h后，再采用凋亡抑制因子存活素(survivin，1nmol/L)预处理细胞24h，之后分别以浓度为5、10、20μmol/L姜黄素干预细胞24h。

1.3 HSCs内脂滴的观察 采用油红O染色法。将油红O溶于60%异丙醇，以4%甲醛固定细胞15min，加入油红O溶液染色10min，60%异丙醇漂洗2min除去多余染料，苏木素复染，40倍显微镜下观察HSCs内脂滴。静止状态下HSCs内脂滴油红O染色呈暗红色。

1.4 ELISA法检测细胞内TG和FFA含量 按照TG或FFA检测试剂盒说明书，采用ELISA方法检测细胞内的TG和FFA含量。

1.5 脂质代谢相关基因表达的检测 采用RTqPCR检测脂质代谢相关基因的表达。使用TRI试剂提取HSCs细胞总RNA，用高效RNA-cDNA 试剂盒合成第一条互补DNA链；用2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒检测脂质代谢相关基因固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)、自水解酶域包含蛋白5(abhydrolase domain containing 5，abhd5)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的mRNA水平。引物序列如表1所示。以GAPDH为内参照，采用2–ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences in real-time PCR

1.6 脂质代谢相关蛋白表达的Western blotting检测收集并裂解细胞，提取总蛋白，按常规操作进行SREBP1c、FAS、abdh5、ATGL的Western blotting检测，蛋白条带通过化学发光显影，目标蛋白表达量通过β-actin进行校正。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有数据均以表示，多组间比较采用Oneway ANOVA分析，进一步两两比较采用post hoc检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对HSCs内脂滴的影响 以5、10、20μmol/L姜黄素干预活化HSCs和AML12细胞后，镜下可见随着姜黄素浓度增加，HSCs内暗红色脂滴数量逐渐增多，表明姜黄素可恢复小鼠HSCs内脂滴水平，作用呈剂量依赖性；而姜黄素对AML12细胞内脂滴无明显影响(图1)。

图1 姜黄素对肝星状细胞内脂滴水平的影响(×40)Fig.1 Effect of curcumin on HSCs' lipid droplet levels (×40)

2.2 姜黄素对小鼠HSCs脂质水平的影响 ELISA检测结果显示，采用5、10、20μmol/L浓度姜黄素干预细胞后，小鼠肝星状细胞内TG含量[分别为(1.495±0.230)nmol/mg protein、(3.758±0.717)nmol/mg protein、(4.490±0.360)nmol/mg protein]与对照组[(1.176±0.343)nmol/mg protein]比较明显升高(P＜0.01)；FFA含量[分别为(57.250±1.463)nmol/mg protein、(78.425±1.030)nmol/mg protein、(111.150±2.350)nmol/mg protein]与对照组[(28.750±2.433)nmol/mg protein]比较明显升高(P＜0.01)，且作用呈剂量依赖性。使用凋亡抑制因子survivin抑制细胞凋亡后，细胞内TG和FFA含量与未使用survinvin时比较无明显变化(图2)。

图2 姜黄素对肝星状细胞甘油三酯和游离脂肪酸的影响(n=3)Fig.2 Effects of curcumin on TG and FFA levels in HSCs (n=3)

2.3 姜黄素对小鼠肝星状细胞脂质代谢相关基因mRNA及蛋白表达的影响 RT-qPCR和Western blotting检测结果显示，姜黄素明显上调了FAS和SREBP-1c基因的mRNA和蛋白的表达(P＜0.01)，明显下调了ATGL基因及蛋白的表达(P＜0.05)，但对abhd5基因表达无明显影响(P＞0.05，图3)。

图3 姜黄素对肝星状细胞脂质代谢相关基因SREBP-1C、FAS、ATGL、abhd5表达的影响(n=3)Fig.3 Effects of curcumin on the expression of genes related to the lipid metabolism of activated HSCs (n=3)

3 讨 论

研究表明，尽管不同原因导致的肝脏疾病表现出不同的病理变化，但HSCs活化是肝纤维化发生发展过程中的一个重要事件和共同途径，是肝纤维化的细胞基础。HSCs胞质内的脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器，它参与了脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解，以及某些信号传导。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病，往往都伴随着脂滴的异常[4]。肝脏损伤过程中，静止的HSCs发生明显的表型变化，包括细胞增殖分化、细胞内脂滴丢失及α-平滑肌肌动蛋白的重新表达、细胞外基质的过度沉积等，这一过程即为HSCs活化。激活的HSCs通过增生和分泌过多的细胞外基质引起肝纤维化的形成。鉴于此，从抑制HSCs活性入手来减少细胞外基质的产生已成为目前治疗肝纤维化的研究热点[5]。HSCs脂滴消失是细胞活化的特征之一，细胞内脂质聚集能够有效抑制HSCs的活化[6]。

细胞脂滴内脂肪的来源除从细胞外摄入与转运外，主要依赖内源性的脂肪合成。肝脏脂肪生成在转录水平受到一系列调节蛋白调控，这些调节蛋白包括SREBP-1c、过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、肝X受体α(liver X receptor α，LXRα)等。SREBP-1是SREBP家族成员之一，SREBP-1有两种亚型，即SREBP-1a和SREBP-1c；在肝脏中SREBP-1a和SREBP-1c的mRNA表达比例为1:9，在HSCs中其比例为1:4；SREBP-1a主要促进脂肪酸和胆固醇的合成，而SREBP-1c则在甘油三酯和磷脂形成中发挥重要作用[7]。有研究表明，地骨皮甲素能够通过下调SREBP-1c 的表达而抑制脂肪肝的形成[8]；而Lee等[9]研究发现，SREBP-1能够调节FAS、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(stearyl coenzyme A desaturase -1，SCD-1)、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)等促进FFA及TG合成的基因表达，发挥促进HSCs脂滴堆积的作用。

另外，脂质分解在维持脂质平衡方面的作用亦不容忽视。脂质分解受ATGL、激素敏感性脂肪酶及单酰基甘油酯酶调节，其中ATGL是脂肪分解的限速酶。AGTL活化须与abhd5相关联活化后才能发挥催化作用。abhd5是ATGL的辅助活化因子，协助ATGL催化TG分解生成甘油二酯和FFA[10]。ATGL和abdh5之间的关联关系被打破，或任何一方发生突变都会影响ATGL的活性，从而导致异位脂质堆积。

在正常肝组织内，HSCs处于静止状态，细胞内存在大量脂滴；而在纤维化过程中，HSCs激活，产生大量细胞外基质的同时，细胞内脂滴丢失[6,11]。有研究表明，激活的HSCs内恢复脂滴形成后，细胞就会返回到静止状态，并明显抑制产生胶原蛋白的能力[12]。

本研究采用不同浓度的姜黄素对HSCs进行干预，结果显示，姜黄素呈剂量依赖地增加了HSCs内脂滴形成及脂肪水平，但对肝细胞AML12内脂肪水平没有影响，说明姜黄素只对HSCs起作用；进一步针对脂质代谢相关分子的研究表明，姜黄素通过增加脂肪的合成及抑制脂肪的分解来达到积累脂肪的目的。有研究发现，姜黄素在一定浓度下可抑制HSCs的增殖，并促进其凋亡。为证实HSCs细胞内脂滴的变化不是HSCs促进凋亡的结果，本研究采用凋亡抑制因子survivin(1nmol/L)处理细胞，未发现姜黄素的作用受到明显影响，表明恢复HSCs脂质水平可能是姜黄素抑制HSCs活化的机制之一。

另有研究证实，姜黄素可通过调节瘦素及瘦素受体表达而在抗肝脏脂肪变性及抗肝纤维化中发挥作用[13-14]，但其通过调节HSCs内脂滴水平发挥抗纤维化的作用是否与瘦素受体相关，尚须进一步研究。

综上所述，姜黄素可通过调节脂质代谢相关基因的表达促进HSCs脂滴堆积，且对肝实质细胞脂滴水平无明显影响，提示姜黄素在肝纤维化的治疗中具有一定的应用潜力。