抗幽门螺杆菌便餐粉配方优化及其体外抑菌研究

邱俊杰， 孙礼进， 张忠宝， 李 浩， 张 智

(四川轻化工大学a.生物工程学院;b.化学工程学院, 四川 自贡 643000)

引 言

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃炎、胃溃疡、胃癌等多种疾病的致病因子。Hp感染率极高，在全球感染率超过50%以上，在不同的国家和地区，感染率也大不相同，在发达国家感染率为30%～50%，而发展中国家感染率高达80%以上，并且感染人群偏向低龄化[1]。幽门螺杆菌感染已于2015年被定性为传染性疾病[2]。临床上治疗Hp的感染，多采用抗生素多联疗法，但维持时间短，而且长期用药容易造成肠道菌群混乱和耐药性的增加，从而导致治疗Hp的感染更加困难[3-4]。

Hp的感染与其结构有着极大的关系[5-6]，目前已经熟知的致病因子主要有鞭毛、黏附素、脲酶、空泡毒素、中性粒细胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NAP)等。鞭毛主要为Hp提供动力，使其可以快速穿过胃酸，到达中性的粘液层；尿素酶通过将尿素分解形成氨和二氧化碳，在菌体周围形成氨云保护层，从而可以抵御胃酸对菌体的损伤，并有利于菌体定植胃黏膜上；当Hp到达胃黏膜时，黏附素将与胃黏膜上皮细胞的受体紧密结合，继而损伤上皮细胞；空泡毒素可以使靶细胞发生空泡化，细胞骨架重排，细胞死亡等形态学的改变。这些致病因子的发现有利于对Hp治疗提供新的靶点，如Hp血型抗原结合粘附素(Blood group antigen binding adhesion，BabA2)、尿素酶B亚单位(urease B subunit，UreB)和鞭毛蛋白A亚单位(Flagellin A subunit，FlaA)等作为疫苗的应用已被建立。

卵黄抗体(Yolk antibody，IgY)是鸟类在受到某种抗原刺激时，在血液中形成特异性抗体，并将这些抗体转移到卵黄中，其本质是卵黄免疫球蛋白。特异性IgY通过直接与病原菌的靶点相结合，改变其整体结构，从而达到抑制作用，此外在消化酶的作用下，一部分IgY被分解成小肽(Fab)，被机体吸收进入血液后，可与血液中的病原体黏附素结合，从而使其失去致病性。国内外研究者已经对IgY的优越性特性有了清楚的认识，已被广泛应用于食品，疾病预防，免疫检测等多个领域[7-9]。

但IgY存在于卵黄液中，单纯的提取IgY，耗时耗力，成本高，而且造成大量蛋白质资源的损失，甚至会污染环境。此外，鸡蛋在贮存过程中，由于受外界湿度，温度以及贮存方式等的影响，容易发生腐败变质[10]。

基于此，本文将高免蛋液(BabA2、UreB和FlaA免疫产蛋鸡制备)制备成高免蛋粉，与其他配料混合，开发一种具有抗幽门螺杆菌功能的便餐粉，不仅对治疗和预防Hp的感染具有重要的社会价值，还能形成新的经济增长点。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine, TMB)单组份显色液(碧云天生物科技公司)，HRP标记的山羊抗鸡抗体(美国Sigma公司)，新生胎牛血清(Invitrogen公司)，高免鸡蛋(四川轻化工大学生物制药教研室实验室制备)，Hp液体培养基、Hp选择性添加剂(青岛海博生物技术有限公司)，其他化学试剂均为分析纯。

YQX-II型微需氧培养箱(美国Gene Science)，DHp-9160B型电热恒温培养箱(上海琅玕实验设备有限公司)，YC-3000型喷雾冷冻干燥机(上海雅程仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 高免蛋粉制备

收集高免鸡蛋，清水洗净蛋壳，去蛋清留蛋黄，称重放入65 ℃烘箱杀菌40 min，冷却至室温备用。按照YC-3000喷雾冷冻干燥机说明书进行物料器的安装，打开通风循环通道，关闭出水孔，保持密闭状态，将制冷机的循环泵打开循环10 min后开始制冷，待物料器内的温度降至-35 ℃，安装进料设备，设定蠕动速度为25 r/min，保持物料温度为-15 ℃以下，结束进料后，打开冷井阀门，关闭风机，关闭物料器两侧阀门，打开真空机及真空阀门，至物料器内真空度小于150 Pa，冷井温度达-40 ℃，开始加热，设定温度为50 ℃，工作数小时后，关闭加热，物料温度在时间段内不再上升时关机取料，蛋黄粉称重。

1.2.2 便餐粉制作工艺

将燕麦米、糯米通过膨化工艺熟化；葛根洗净，加入适量水，放入高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃熟化20 min后立即取出，将其放置于100 ℃烘箱中烘干后，放入粉碎机中将其粉碎，过100目筛网，即得葛根粉。将燕麦粉、糯米粉，葛根粉，紫薯粉，脱脂奶粉，麦芽粉按照一定的比例混合均匀，在以上配方的基础上，添加木糖醇，麦芽糊精和高免蛋粉，即得便餐粉，参考马永轩[11]等方法，通过单因素和正交实验优化配方改善便餐粉的品质。

1.2.3 便餐粉品质指标的测定

(1) 休止角的测定：将洁净玻璃放置于水平实验台上，将洁净的漏斗放置于铁架台上，垂直悬空，下端距离玻璃面3 cm，准确称取便餐粉3 g，缓慢倒入玻璃漏斗，让其自然滑落，测定堆积物的直径和高度，各测量3次取平均值，按照tanθ=2×h/d求其休止角。

(2) 堆积密度的测定：准确称量便餐粉20 g，缓慢倒入100 mL洁净量筒中，测定体积，重复三次求其平均值，按照质量/体积即得堆积密度。

(3) 结块率的测定：准确称量便餐粉30 g，加入65 ℃的温水，搅拌至无干粉存在，静置冷却至室温，用20目筛进行过滤，滤渣用水洗净，吹风机吹干后，将干结物块与筛网共同称重，总质量减去筛网质量即为结块率，重复三次。

(4) 管道流动性的测定：准确称量便餐粉30 g，加入65 ℃的温水 105 mL，搅拌至无干粉存在，静置冷却至室温，缓慢倒入鼻饲管中，记录5 min流出的总体积，计算出流动速率(单位时间流出的体积mL/min)，重复3次。

(5) 管道挂壁的测定：准确称量便餐粉30 g，加入65 ℃的温水105 mL，搅拌至无干粉存在，静置冷却至室温，缓慢倒入鼻饲管中，待其全部流出后，带鼻饲管称重，总质量减去鼻饲管质量即为管道挂壁重量，重复3次。

1.2.4 单因素试验设计

参照1.2.3的方法，分别测定木糖醇、麦芽糊精和高免蛋粉添加量对便餐粉休止角、堆积密度、结块率、管道流动性和挂壁量的影响。

1.2.5 正交实验设计

在单因素试验的基础上，以木糖醇、麦芽糊精和高免蛋粉的添加量为因素，通过SPSS17.0软件设计L9(33)正交表，见表1，测定每组配方的休止角、堆积密度、结块率、管道流动量以及挂壁量，并将每组配方冲调后随机邀请人员进行品尝打分，评分标准见表2，对配方进行优选。

表1 正交因素水平表

表2 评分标准

1.2.6 便餐粉效价稳定性测定

优选出最佳配方后，将便餐粉用全自动包装机包装后，分别放入-20 ℃、4 ℃、37 ℃、65 ℃，通过间接Elisa法测定便餐粉和高免蛋粉的OD450值，具体如下：用pH=9.6的磷酸盐缓冲液将UreB蛋白稀释至10 ug/mL作为包被液，加入96孔板，每孔100 μL，4 ℃静置12 h，PBST洗涤，每次3 min，重复三次；加入5%脱脂奶粉于37 ℃封闭1.5 h，PBST洗涤同上；将便餐粉和高免蛋粉稀释2500倍后加入96孔板，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤同上；加入二抗(HRP标记的山羊抗鸡抗体)，每孔100 μL，37 ℃反应1 h，PBST洗涤同上；加入TMB单组份显色液，每孔100 μL于暗处显色5 min；最后加入1 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm测定吸光度，P/N>2.1为阳性(见公式1)。

P/N=(A待测样品-A空白对照)/

(A待测阴性对照样品-A空白对照)

(1)

1.2.7 便餐粉体外抑菌实验

Hp的培养：按照Hp固体培养基的配方灭菌后，冷却至50 ℃左右，加入1/100的Hp选择性添加剂(含1 mg/mL头孢磺啶，0.5 mg/mL两性霉素，1 mg/mL万古霉素，2 mg/mL甲氧苄啶)，7%的胎牛血清，于超净工作台凝固30 min，取-80 ℃保存的Hp菌种50 μL涂布于培养基上，于微需氧培养箱(85%N2，10%O2，5%CO2)中培养5～7天，挑取单菌落于Hp液体培养基中，37 ℃微需氧培养5～7天，调整Hp菌液浓度为108CFU/mL，备用。

将便餐粉溶于Hp灭菌液体培养基中，0.22 μm滤膜过滤除菌，将其与等体积浓度为108CFU/mL Hp菌液混合，调整便餐粉的浓度分别为20 mg/mL、40 mg/mL和60 mg/mL，最后均加入1/100的Hp选择性添加剂，7%的胎牛血清，放入37 ℃微需氧条件培养。每隔12 h在超净工作台收集样品200 μL，600 nm测定吸光度。

1.2.8 统计学方法

2 结 果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 麦芽糊精对便餐粉品质指标的影响

(1) 麦芽糊精添加量为20%和25%的休止角显著低于10%、15%和30%(44.38±0.14°、43.85±0.16° vs 47.15±0.25°、47.56±0.21°、45.66±0.23°，P<0.05)，如图1所示。

注：图中小写字母表示0.05水平下的差异显著性，下同
图1 麦芽糊精添加量对便餐粉休止角的影响

(2) 随着麦芽糊精添加量的增大，便餐粉的各组堆积密度之间无显著性差异，如图2所示。

图2 麦芽糊精添加量对便餐粉堆积密度的影响

(3) 随着麦芽糊精添加量的增加，便餐粉的结块率从26.70%±1.10%降低到15.26%±0.88%各组之间呈显著性差异(P<0.05)，如图3所示。

图3 麦芽糊精添加量对便餐粉结块率的影响

(4) 随着麦芽糊精添加量的增大，便餐粉的流量从(13.03±0.05) mL/min升高到(18.65±0.04) mL/min，如图4所示。

图4 麦芽糊精添加量对便餐粉流动性的影响

(5) 麦芽糊精添加量从10%增加到15%时，挂壁量从(2.78±0.52) g增加到(2.99±0.67) g当添加量超过20%时，挂壁量无显著性差异，如图5所示。

图5 麦芽糊精添加量对便餐粉挂壁的影响

2.1.2 高免蛋粉对便餐粉品质指标的影响

(1) 高免蛋粉添加量从5%增加到20%时，休止角由46.32±0.42°增加到48.66±0.55°(P<0.05)，添加量大于20%时，粉体休止角无显著性差异，如图6所示。

图6 高免蛋粉添加量对便餐粉休止角的影响

(2) 随着高免蛋粉添加量从10%增加到15%，堆积密度由(0.43±0.04) g/mL降低为(0.35±0.03) g/mL(P<0.05)，添加量超过15%时，各组堆积密度之间无显著性差异，如图7所示。

图7 高免蛋粉添加量对便餐粉堆积密度的影响

(3) 随着高免蛋粉添加量的增加，结块率由19.34%±0.54%增加到26.53%±0.44%，15%的与20%的结块率呈现显著性差异(20.71%±0.52% vs 24.34%±0.56%，P<0.05)，添加量超过20%时，各组结块率无显著性差异，如图8所示。

图8 高免蛋粉添加量对便餐粉结块率的影响

(4) 高免蛋粉添加量为10%时，流量为(16.57±0.19) mL/min，显著高于5%、15%、20%和25%的流量(P<0.05)，如图9所示。

图9 高免蛋粉添加量对便餐粉流动性的影响

(5) 高免蛋粉添加量低于15%时，各组挂壁量无显著性差异，20%的挂壁量显著高于15%((2.75±0.19) g vs (2.24±0.14) g，P<0.05)，添加量超过20%时，各组挂壁量无显著性差异，如图10所示。

图10 高免蛋粉添加量对便餐粉挂壁的影响

2.1.3 木糖醇对便餐粉品质指标的影响

(1) 随着木糖醇的增加，休止角46.43±1.23°降低至40.01±1.09°，各组之间呈显著性差异(P<0.05)，如图11所示。

图11 木糖醇添加量对便餐粉休止角的影响

(2) 随着木糖醇添加量的增加，各组堆积密度并无显著性差异，如图12所示。

图12 木糖醇添加量对便餐粉堆积密度的影响

(3) 木糖醇添加量为10%时，结块率最小为6.70%±0.06%，与1%、5%、15%和20%添加量呈显著性差异(P<0.05)，如图13所示。

图13 木糖醇添加量对便餐粉结块率的影响

(4) 木糖醇添加量为10%和15%的流量显著高于1%、5%和20%的流量((19.74±1.15) mL/min、(18.46±1.22) mL/min vs (10.44±0.88) mL/min、(12.51±0.88) mL/min、(12.33±0.83) mL/min，P<0.05)，如图14所示。

图14 木糖醇添加量对便餐粉流动性的影响

(5) 随着木糖醇添加量的增加，各组挂壁量之间无显著性差异，如图15所示。

图15 木糖醇添加量对便餐粉挂壁的影响

2.2 正交实验结果

三个因素对便餐粉综合得分的影响顺序为：高免蛋粉>麦芽糊精>木糖醇，最佳组合为A2B2C1，即麦芽糊精添加量为20%，高免蛋粉添加量为15%，木糖醇添加量为10%，见表3。

表3 正交实验结果

各组的品质指标的测定，见表4。通过SPSS17.0软件分析评分与五个指标之间的相关性，休止角，结块率与评分呈显著性负相关(P<0.05)，流动性与评分呈极显著性负相关(P<0.01)，见表5。

表4 各组品质指标测定

表5 得分与指标之间的相关性

*：相关性显著(P<0.05)；**：相关性极显著(P<0.01)

2.3 便餐粉效价稳定性检测

连续测定4个月同一批次的高免蛋粉及便餐粉OD450值，如图16与图17所示。高免蛋粉和便餐粉在4 ℃和37 ℃时的各组OD450值无显著性差异，在65 ℃时的OD450值均显著低于4 ℃和37 ℃(P<0.05)。经P/N计算，高免蛋粉在65 ℃条件下2个月后效价已成阴性(P/N<2.1)，而便餐粉效价在4个月检测期内均为阳性(P/N>2.1)。

图16 温度对高免蛋粉效价影响

图17 温度对便餐粉效价的影响

2.4 便餐粉体外抑菌

随着便餐粉浓度的增加，同一时刻的OD600值逐渐降低(P<0.05)，当便餐粉浓度达60 mg/mL时，在72 h内，各组的OD600值无显著性差异，如图18所示。

图18 便餐粉体外抑菌结果

3 讨 论

目前高免蛋液干燥的方法主要是热风喷雾干燥，许多研究者利用此干燥方法获得的高免蛋粉可以代替抗生素治疗某些疾病[12]，但在此过程中，高温会影响IgY的活性。在本研究中，采用喷雾冷冻干燥生产的高免蛋粉，在常温下4个月内保持高效价，并且所得的产物为粉末状，复水性好，乳化性强(未发表数据)。说明喷雾冷冻干燥更适合高免蛋液的工业化生产，与其他研究者得出结论一致[13-14]。

通过膨化技术获得的膨化粉稠度高，更有利于便餐粉口感的调节，但遇水容易形成糊化层，不易溶解，形成结块[11]。市场上的粉剂产品多采用添加食品添加剂的方法加快粉剂溶解，众所周知，食品添加剂的副作用众多。因此本研究通过调整配方的添加量优化便餐粉的冲调性和溶解性，单因素实验发现麦芽糊精和木糖醇可以降低便餐粉结块率，可能是破坏了糊化层的形成，高免蛋粉由于油脂含量高结合膨化粉糊化层的形成，导致结块率提高。通过正交实验得出高免蛋粉，木糖醇和麦芽糊精对便餐粉品质的影响程度，并且得出了休止角、结块率、流动性与综合得分的相关性，为便餐粉的进一步优化奠定了基础，同时也为其他粉剂产品的研发提供了新的思路。

通过持续监测高免蛋粉和便餐粉的OD450值，我们发现，高免蛋粉与便餐粉在低温环境下，效价可维持更长时间，所以此便餐粉适于低温保存，并且在65 ℃的条件下，便餐粉的效价可维持4个月以上，而高免蛋粉仅能维持2个月左右，推测便餐粉中的配料对IgY存在保护作用，体外抑菌实验表明便餐粉可抑制Hp的生长，并且当浓度达到60 mg/mL时，即可在时间段内达到完全抑制的效果。说明了制备出的便餐粉具有治疗Hp感染的潜能。