谷氨酰胺转运蛋白ASCT2的研究进展

梁宝瑜，金 春，高俪原，李余佳，王桭屹，张 峰，2，3，郑仕中，2，3

[南京中医药大学 1. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室、2. 江苏省中药功效物质重点实验室、3. 中药品质与效能国家重点实验室(培育)，江苏 南京 210023]

谷氨酰胺是人体内含量最丰富的一种非必需氨基酸。而在高增殖率细胞(如炎症细胞、干细胞、肺癌细胞)中，谷氨酰胺代谢明显增加。谷氨酰胺进入胞质后，在谷氨酰胺酶的作用下，转变为谷氨酸，再进一步在谷氨酸脱氢酶等的作用下变为α-酮戊二酸(α-KG)，回补三羧酸循环，为线粒体氧化磷酸化提供碳源，保障细胞的能量供应，因为能量代谢稳态是维持心肌细胞等机体细胞形态稳定和功能的正常的重要保证[1]。谷氨酰胺的酰胺基和氨基还可以为多种重要生物分子(如非必需氨基酸、核苷酸、己糖胺等)的合成提供氮源，保障细胞的持续增殖。此外，谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要前体，在维持细胞氧化还原稳态中起关键作用[2]。谷氨酰胺还可以作为药物，提高小鼠大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞抗凋亡能力，增强保护性蛋白HSP70的表达[3]。因此，谷氨酰胺代谢在细胞(特别是高增殖率的细胞)的蛋白质和能量代谢中起着核心作用。

谷氨酰胺必须通过细胞膜上特异性载体的转运，才能进入细胞内发挥作用，其中命名为丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)的Na+依赖性谷氨酰胺载体ASCT2最为重要。人ASCT2在正常的肺、骨骼肌、大肠、肾脏、睾丸、脑中广泛表达[4]。另外，研究表明[5]，ASCT2在结直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌和脑癌中的表达明显增加，表明谷氨酰胺转运体ASCT2与人类生理功能及很多重大疾病有密切关联。本文主要综述ASCT2的细胞生物学功能及其在疾病中的调控作用的相关研究进展。

1 ASCT2的生物学功能

2 ASCT2生物学功能的调控

2.1 ASCT2翻译后修饰在细胞生物学中，蛋白质翻译后修饰作用对蛋白质活性的调节、稳定性，以及与其他蛋白的相互作用等细胞过程起着至关重要的作用。研究发现[12]，ASCT2翻译后修饰的一个典型路径——N-糖基化。N-糖基化路径能够精确地定位蛋白质在细胞质膜中的位置。据报道，有研究根据生物信息学预测的ASCT2的N-糖基化位点是2个天冬氨酸残基(N163和N212)，然后用定点突变的方法取代这两个残基，验证了ASCT2存在N-糖基化的靶点。Garaeva等[6]的三维结构显示，N212暴露在细胞外环境中，而N163隐藏在结构的间隙中，该三维结构更直观地证明了N-糖基化位点的存在。但是，Console等[13]在完整细胞和重组的ASCT2蛋白质脂质体中进行的研究结果表明，N-糖基化/去糖基化状态对ASCT2蛋白Na+依赖性反向转运中性氨基酸的内在转功能影响不大，但N-糖基化对ASCT2转运到膜上的过程至关重要。所以非糖基化重组的ASCT2适用于人ASCT2的功能研究。

在细胞不同的生命时期，同一个分子可能有不止一种的修饰作用，而且这些作用可能是短暂的，也可能是稳定持久的。Aebersold等[14]发现另一个常见的ASCT2翻译后修饰作用是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化。磷酸化通常与蛋白功能的特殊阶段(信号激活或抑制)联系在一起。前期文献报道，在表达人类ASCT2异构体的X卵母细胞中，放射性标记的丝氨酸的摄取受到蛋白激酶SGK1、3和PKB活性的影响，但该研究没有明确ASCT2序列中的磷酸化序列。Palmada等[15]假设激酶活性对ASCT2的动力学最大转运速度Vmax有影响，但不影响它的动力学米氏常数(半饱和常数)Km。因此，他们猜测ASCT2磷酸化位点不在常规位点，或者是因为另一个未知的蛋白正在磷酸化来反过来调节ASCT2的活性。ASCT2除了N-糖基化和丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的磷酸化等翻译后修饰外，还有赖氨酸泛素化和乙酰化，以及精氨酸单甲基化，但是对这些修饰作用的生物学意义的研究尚不够清晰，因此本文不作阐述。

2.2 ASCT2的蛋白-蛋白间相互作用前期研究报道，ASCT2是雷帕霉素(mTOR)信号通路质膜上的一种蛋白，它的一个重要的功能是与mTOR信号通路的联系。mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶，通过与ASCT2以及其他几种蛋白的相互作用，形成两个复合物(mTORC1和mTORC2)，参与生长、能量代谢、氨基酸代谢等多种信号途径。早前研究发现，人ASCT2与PDZK1(参与调节许多SLC家族成员的支架蛋白)有物理性相互作用，后续研究证明，这种物理性相互作用是通过与一类PDZ结合域结合发生的[11]。PDZ结合域是人类基因组编码的最常见的蛋白质相互作用域。近期研究发现，另一种结合蛋白质的PDZ结合域为SNX 27(sorting nexin 27)，它通过与ASCT2结合来提高ASCT2在质膜中的稳定性，从而增强谷氨酰胺的摄取，来保证细胞对能量和氮源的需求，另一方面，增强氨基酸刺激下的mTORC1激活[16]，促进细胞的生长增殖。另有研究发现，衔接因子相关蛋白复合体1(adaptor-related protein complex 1 gamma 1，AP1G1)与ASCT2、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)有物理性相互作用，并形成ASCT2-AP1G1-EGFR异三聚体复合物，通过共同靶向ASCT2和EGFR，可以克服人头颈部鳞状细胞癌(human head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)对西妥昔单抗的耐药性[17]。

2.3 氧化还原对ASCT2转运活性的调节作用半胱氨酸残基在蛋白质修饰中具有多种调节作用，还参与调控细胞的氧化还原状态。Scalise等[9]利用重组的人ASCT2蛋白脂质体进行的研究表明，ASCT2可以感知影响半胱氨酸残基的氧化还原状态的化合物，或者能够感知直接和半胱氨酸残基发生反应的化合物。其中，这些还原态的化合物能刺激ASCT2的动力学最大转运速度(Vmax)，但不影响ASCT2对底物的亲和力；而氧化态的化合物通过形成二硫键，会损害ASCT2蛋白质的功能。这些研究结果表明，还原态的半胱氨酸残基有助于ASCT2的转运功能。后续研究采用定点突变技术，构建了ASCT2在毕赤酵母(P.Pastoris)(外源蛋白真核表达体系之一)中过表达的8个半胱氨酸-丙氨酸(Cys-Ala)突变体，该研究结果发现，7个Cys-Ala突变体不影响ASCT2的转运活性，但是与含巯基试剂发生反应。只有位于核心区域的第467位半胱氨酸残基C467的突变体不但能够感知生理浓度下的含巯基试剂，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，并且是ASCT2与底物的结合以及易位的关键区域。这些结果表明，半胱氨酸残基可能在生理条件下导致活化的还原性蛋白与非活化的氧化蛋白之间的相互转换，从而使得ASCT2活化或者失活，因此，半胱氨酸残基C467对ASCT2转运活性至关重要。

3 ASCT2在疾病中的作用

3.1 ASCT2在肿瘤组织中的调节目前，对ASCT2的研究主要是在能够获取可重复信息的癌细胞或永生化细胞系的模型中进行的。由于肿瘤细胞的代谢重排，在这些模型中研究的分子机制与正常组织中的分子机制有很大的不同。所以，ASCT2在疾病中的调控知识是复杂的。现阶段的研究表明，ASCT2具有向细胞转运，参与代谢和信号通路转导的氨基酸的功能。该功能可能与肿瘤相关蛋白有关联。例如，Reynolds等[18]的研究发现，通过E2F-3(transcription factor 3，E2F-3)诱导的ASCT2的过度表达，导致肿瘤抑制因子成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb，RB或RB1)的下调。由于细胞周期进程需要合成多种新物质，而谷氨酰胺为多种重要生物分子(如核苷酸、非必需氨基酸等)的合成提供氮源，在蛋白质和能量代谢中起着核心的作用，因此，Rb也可能直接调控参与谷氨酰胺代谢的蛋白质ASCT2。另一方面，谷氨酰胺转运蛋白ASCT2和谷氨酰胺代谢在多种肿瘤细胞生存和增殖中起着关键的作用。MicroRNA的调控研究揭示，miRNA-137与ASCT2在多种肿瘤中具有负相关的关系。在甲基-CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)作用下，miRNA-137启动子区域发生去甲基化反应，从而增强其对下游ASCT2的抑制作用，进一步抑制ASCT2表达以及谷氨酰胺代谢，导致肿瘤细胞死亡[19]。因此，ASCT2在肿瘤组织中的调节作用与其谷氨酰胺的转运功能，以及谷氨酰胺的代谢密切相关，可通过直接调控ASCT2的表达，或者通过ASCT2的上下游因子调控ASCT2的表达来调控谷氨酰胺代谢，抑制肿瘤细胞生存和增殖。

3.2 ASCT2在非肿瘤组织的调控ASCT2在肿瘤细胞中的调节作用已有较多研究，然而，其在非肿瘤组织中的调控作用的研究较少。Yi等[20]研究表明，谷氨酰胺由ASCT2转运进入猪肠细胞，然后通过激活mTOR信号通路而不依赖AMPK信号通路，促进猪肠细胞的生长。Liu等[21]在小鼠乳腺中的研究揭示，ASCT2的表达与依赖mTOR的氨基酸传感器G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)有关，ASCT2可能通过GPCRs来调节乳蛋白的合成。因此，Liu等认为ASCT2可以作为调节乳蛋白合成的分子靶点。ASCT2在非肿瘤组织中的调控主要通过其转运谷氨酰胺的功能来调节细胞生长，以及参与乳蛋白合成的调控。

4 ASCT2抑制剂的研究

谷氨酰胺转运体ASCT2参与乳腺癌、肝癌等多种疾病的调控，因此，ASCT2可能是药物的重要靶点，研究ASCT2的抑制剂可能是疾病治疗的一个重要策略。较早的研究发现，以ASCT2首选底物谷氨酰胺衍生物的结构为基础，发现苄基丝氨酸(benzylserine)和苄基半胱氨酸(benzylcysteine)对大鼠ASCT2的具有竞争性抑制作用，表明可用底物模拟药物来研究ASCT2的抑制剂。后续研究发现，侧链空间位阻小、疏水性低的氨基酸衍生物与ASCT2结合位点具有很强的相互作用[22]，它以更高的亲和力与ASCT2结合，从而竞争性地抑制或者阻断谷氨酰胺与ASCT2结合。而近年利用大鼠ASCT2重组的蛋白脂质体进行的研究，发现ASCT2能通过与鼠序列中存在一种金属结合模体(CXXC)与Hg及其有机衍生物等金属发生反应，从而抑制ASCT2对谷氨酰胺的转运[23-24]。然而据报道，人ASCT2失去了CXXC序列，但是ASCT2的半胱氨酸残基依然能够与Hg衍生物形成共价键，可以不可逆转地阻断ASCT2的活性[4,6,22]。ASCT2共价抑制的发现能够避免在某些条件下，内源性氨基酸(特别是谷氨酰胺)的增加，会将ASCT2抑制剂从结合位点上转移的问题。近年来，在研究ASCT2的抑制剂的过程中，发现苄基脯氨酸衍生物能够影响ASCT2的转运活性，基于苄基脯氨酸衍生物支架基础研究的ASCT2靶向性竞争性抑制剂应运而生[25]。

5 结论

ASCT2是细胞摄取谷氨酰胺的最重要的转运体，对维持细胞谷氨酰胺稳态，以及依赖谷氨酰胺代谢的细胞的存活和增殖至关重要。然而，氨基酸在细胞中的稳态是一个错综复杂的网络，化学上或基因上单纯阻断一个靶点的想法并不是适用于所有病理情况。同时，ASCT2在正常组织中也有广泛表达和重要作用，直接靶向这种转运可能会影响到正常组织的生理活动。所以深入研究ASCT2的功能及其调节，对揭示这种蛋白在生理和病理条件下的作用尤其重要，而最近研究得到的ASCT2冷冻电镜结构，将为理解ASCT2的结构功能及其抑制剂的研究提供更精确的靶点，对设计出高效的，对正常组织生理活动影响小的靶向性的ASCT2抑制剂具有指导意义。