筛查RET融合基因在鼻咽癌组织和细胞系中的表达情况

2020-04-11 13:54赵东何磊张丽平何静波
临床检验杂志(电子版) 2020年3期
关键词:石蜡细胞系鼻咽癌

赵东,何磊,张丽平,何静波

(1.包头医学院第二附属医院,内蒙古 包头 014000;2.包头医学院,内蒙古 包头 014000)

研究发现,RET基因移位的细胞系对RET抑制剂敏感,其可能为治疗RET活化肿瘤提供新的选择。本次研究主要探讨RET融合基因在鼻咽癌组织、细胞系中的表达情况,从而为发现新的治疗方式与靶点提供参考,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对2016年6月-2019年6月期间收治鼻咽癌患者60例进行研究,其中包括男性54例、女性6例,年龄为20-74岁、中位年龄46.5岁,组织病理分期为II型11例、III型54例,其中不包括远处转移的患者。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 标本为经过福尔马林固定的石蜡标本,经病理专家重新确认。组织芯片仪进行组织芯片的构建,供体石蜡标本进行切薄片,HE染色,选取供体蜡块标本典型肿瘤区域穿孔2个,进行芯片构建。芯片上的标本参数为:直径1 mm,间距0.1 mm。于3块组织芯片上构建所有标本,每个肿瘤均有对应位点共2个。构建完毕受体石蜡块后,4

μm连续切片并放在载玻片上。鼻咽癌细胞系为S26、S18、

HONE-1、CNE-1、CNE-2以及SUNE-1,均保存于重点实验室,细胞系铺板,秋水仙碱(0.05 g/mL)作用4 h以阻滞细胞周期,多聚甲醛(10%)固定,梯度乙醇脱水。阳性对照物为有KIF5B/RET融合基因的肺癌组织。

1.2.2 FISH检测 56oC烤片上处理石蜡切片,过夜。脱蜡处理后,二甲苯中处理玻片3次,10 min/次,之后将玻片放置于乙醇(100%)中3次,10 min/次。80oC条件下,玻片在预处理溶液中处理10 min,蛋白酶溶液消化15 min后梯度乙醇脱水并自然干燥。2×SSC缓冲液对细胞滴片进行冲洗,持续30 min,乙酸(70%)预处理10 s后,胃蛋白酶(0.008%)消化30 min,甲醛(1%)固定60 s。经处理后的组织标本、细胞系上滴加10 μL探针混合液并将盖玻片盖上,香蕉水泥封片。杂交仪中79oC下变性6 min,37oC条件下杂交过夜。翌日将标本取出,75.5oC条件下,洗脱液快速洗涤2 min,室温下洗涤2次,二脒基苯基吲哚对比染色,荧光显微镜下4oC避光,30 min内评分。HE染色切片上寻找癌细胞区域,物镜下观察FISH标本,寻找HE染色切片同一视野,对信号仔细观察。绿色荧光标记RET基因3’端,红色荧光标记5’端,RET基因融合时,二者重叠,此时染色信号叠加,或表现为黄色,10%以上肿瘤细胞的红绿探针分离则提示RET基因断裂,对每例标本均计数100个肿瘤细胞。

1.5 RT-PCR 试剂盒提取细胞系总RNA,DNA酶将残留DNA去除,对完成的cDNA转录10 ng,进行PCR反应,总反应体系25 μL,其中包括相应缓冲液、1.5 μL dNTP、0.05 mL DNA聚合酶以及上下游引物分别1 μl。95oC下反应1.5 min,94oC下反应30 s,64oC下反应30 s,72oC下反应40 s,共30个循环,72oC下10 min延申。PCR产物进行琼脂凝胶电泳,扫描电泳条带的密度。

2 结果

60例组织标本、6株细胞系中未见探针分离现象。6个鼻咽癌细胞系中,PCR产物核酸电泳见溴化银显色,未见扩增条带。

3 讨论

当前对RET基因进行检测时,免疫组化、FISH、PTPCR都是比较常用的方法[1-3]。FISH检测时,仅需要石蜡切片即可进行检测,其具有简单、快捷的优势,结果明确、直观,比较适合于不容易获得新鲜标本的病例;PT-PCR的优势在于可靠、敏感,其能够获知基因融合类型,但是其对标本要求比较高,要求为新鲜组织,过程比较繁琐。进行RET基因状态检测时,应结合病情需要来制定决策。

鼻咽癌患者无论是复发还是初诊都常见表皮生长因子受体(EGFR)过度表达,EGFR过度激活造成下游信号被激活,从而促进细胞增殖;EB病毒的感染使得EGFR核内转移以及内化,这说明EGFR在鼻咽癌的发生与发展过程中的作用。但是对EGFR信号通路进行抑制,并未对鼻咽癌细胞的增殖造成影响,这说明可能还有其他信号通路参与了病理生理过程。血管生长因子、缺氧相关蛋白碳酸酐酶-9以及缺氧诱导因子1也都在鼻咽癌组织中高表达,其都提示着预后不良。但是当前仍然缺乏鼻咽癌转移、进展、复发的分子机制。从本次研究的结果上看来,RET基因断裂融合现象并未见于鼻咽癌组织、细胞系中,这说明鼻咽癌发生RET基因融合的可能性较低。

综上所述,鼻咽癌的发生与发展过程中,RET基因并未参与其中。

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