芽胞杆菌BJ-10的鉴定及其抑菌活性与防病作用

谢心悦，贾慧慧，杨海清，高坦坦，魏艳敏，任争光*

(1.农业农村部华北都市农业重点实验室，北京农学院，北京 102206；2.北京市平谷区人民政府果品办公室，北京 101200)

长期以来，植物病虫害的防治都是以化学防治为主。化学农药的广泛使用虽然提高了农产品生产效率，但是也存在着对生态环境危害大，农药残留等一些严重问题。因此，生物防治的方法越来越受到大家的关注[1]。芽胞杆菌(Bacillussp.)是目前植物病害生物防治研究和应用最多的生防菌种类之一[2]。芽胞杆菌在自然界中广泛存在，是土壤和植物微生态的优势微生物种群之一，多数为对人畜无害的非致病菌。芽胞杆菌突出的特征是能产生芽胞，芽胞的特殊结构使其具有很强的抗逆性和较好的稳定性，这有利于生防菌的存活与繁殖，对于生防菌剂的生产和剂型的加工也很重要[3-4]。芽胞杆菌对多种植物病害具有很好的控制效果，其对植物病害的生防机制主要为竞争、拮抗、诱导抗性、溶菌作用和促进植物生长等[5]。芽胞杆菌产生的抗菌物质主要有抗生素、抗菌蛋白、细菌素、细胞壁降解酶类等[6]。

本试验从北京农学院试验地分离到一株芽胞杆菌BJ-10，对BJ-10进行了分子生物学鉴定，检测了该菌株的抑菌谱，抗菌物质的抗逆性等，并利用盆栽试验检测了BJ-10发酵液对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治能力。试验结果为生防芽胞杆菌BJ-10的进一步开发和利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株BJ-10分离自北京农学院东大地菜园土壤中，初步认定为芽胞杆菌(Bacillussp.)。菌株BJ-10用LB培养基培养和保存，需要时，发酵培养基为：可溶性淀粉20 g、麸皮10 g、CaCO310 g、Na2HPO32 g、KH2PO31 g，溶于1 000 mL去离子水中，分装后在121 ℃下高压灭菌。

供试植物病原真菌：草莓褐色叶斑病菌(Pilidiumconcavum)、草莓褐色轮纹病菌(Sphaeronaemellafragariae)、棒形拟盘多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、钟器腐霉(Pythiumvexans)和苹果树腐烂病菌(Valsamali)共9株在PDA培养基上培养；供试甜瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)在LB培养基上培养和保存；供试甜瓜白粉病菌保存在甜瓜幼苗上。

1.2 方 法

1.2.1 芽胞杆菌BJ-10的分子生物学鉴定 芽胞杆菌BJ-10在LB液体培养基中37 ℃，150 r/min振荡培养24 h，用细菌DNA快速提取试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)提取BJ-10的总DNA，以此为模板，利用gyrB基因鉴定引物gyrB-up1f/gyrB-up2r进行PCR扩增[7]，PCR产物送测序公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)测序。所得序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中用Blastn软件比对分析，并用MEGA 5.2软件构建系统进化树。

1.2.2 芽胞杆菌BJ-10的抑菌谱测定 芽胞杆菌BJ-10的抑菌谱测定采用对峙培养法。具体步骤为：从培养好的植物病原真菌平板中打取直径为5 mm的菌饼，放置在PDA平皿中央，在距离菌饼3.0 cm处滴加5 μL BJ-10的LB培养液；对甜瓜细菌性果斑病菌拮抗时，将培养好的病原细菌混入LB培养基中，在平皿中央滴加5 μL BJ-10培养液；28 ℃培养3～5 d，观察并测量抑菌带宽度并计算抑菌效果。抑菌效果=(抑菌带宽度/生防菌距离菌饼的距离)×100%。

1.2.3 芽胞杆菌BJ-10的抗菌物质耐热性与耐酸碱性测定 将菌株BJ-10用发酵培养基于28 ℃，180 r/min振荡培养3 d，发酵液用过滤器除去细菌，分别在35、45、55、65、75、85、95 ℃下水浴处理20 min，及121 ℃高压处理20 min，然后以苹果树皮腐烂病菌(V.mali)为指示菌，在PDA平皿距离菌饼3 cm处打孔，加入100 μL不同温度处理的发酵液，28 ℃培养，3 d后测量抑菌带宽度并计算抑菌效果。耐酸碱性测定时，将发酵液调至pH=3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，处理12 h后再调回初始pH值(pH约6.7)，以V.mali作为指示菌，测定抑菌活性变化。

1.2.4 芽胞杆菌BJ-10对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治试验 芽胞杆菌BJ-10对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治试验采用室内盆栽处理的方法。首先，挑选籽粒饱满的健康甜瓜种子(绿翠品种)种植到营养钵中育苗，待幼苗长出1～2片真叶后备用。将菌株BJ-10用发酵培养基于28 ℃，180 r/min振荡培养3 d，培养液用纱布过滤残渣后，添加1‰的吐温80，稀释5倍制备成5-1倍带菌发酵液，用细菌过滤器过滤制备成5-1倍无菌发酵液。

采集室内甜瓜苗上培养的白粉病菌，用毛笔将分生孢子刷入无菌水中，调至2×106CFU/mL；用毛笔将孢子悬浮液均匀刷于待测甜瓜叶片上，放温室中保湿培养6 d左右。设置20%三唑酮乳油1 000倍液、BJ-10的5-1倍带菌发酵液和5-1倍无菌发酵液处理，空白发酵培养基稀释5倍液作为对照，喷雾处理发病甜瓜叶片，每处理重复3盆(每盆4～5棵)，温室培养6～8 d，调查白粉病的发生情况。病情指数和防治效果计算参见汪军等(2017)[8]。防治甜瓜细菌性果斑病时，设置空白LB培养基对照、农用硫酸链霉素1 000倍液、新植霉素1 000倍液，BJ-10的5-1倍带菌发酵液和5-1倍无菌发酵液共5个处理，先喷雾处理生防菌和药剂，再喷雾接种细菌性果斑病菌，保湿培养5～8 d，计算甜瓜苗的病情指数和防治效果，具体参见周洪友等(2009)[9]。

2 结果与分析

2.1 芽胞杆菌BJ-10的菌落形态与分子鉴定结果

从北京农学院东大地菜园土壤中分离到细菌BJ-10，其单菌落乳白色，圆形，边缘不整齐，表面有褶皱(图1)，这与某些芽胞杆菌(Bacillussp.)的菌落形态生长一致，初步认定为芽胞杆菌。为了进一步鉴定芽胞杆菌BJ-10的分类地位，本试验PCR扩增了BJ-10的gyrB基因，经电泳检测到了1 000 bp左右条带，将PCR产物测序后在NCBI数据库中用Blastn软件比对，结果发现BJ-10与解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)相似率最高，达到99%以上。从NCBI网站下载gyrB基因相关序列，构建系统发育树，结果显示BJ-10和解淀粉芽胞杆菌聚在一个分支(图2)，因此BJ-10初步鉴定为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)。

2.2 芽胞杆菌BJ-10的抑菌谱测定结果

利用对峙生长法测定了芽胞杆菌BJ-10对9株病原真菌和甜瓜细菌性果斑病菌的拮抗活性，结果显示(表1)，BJ-10对所测植物病原菌均具有不同程度的拮抗活性，特别是对草莓炭疽菌(C.fragariae)、草莓褐色轮纹病菌(S.fragariae)和苹果树腐烂病菌(V.mali)的拮抗效果最好，抑菌带宽度达到了10 mm以上，抑菌效果在35%左右；其次是甜瓜细菌性果斑病菌(A.citrulli)，抑菌带宽度达到了8.8 mm，抑菌效果为29%；对立枯丝核菌(R.solani)抑制作用最弱，为3.7 mm，抑菌效果为12.3%左右。

图1 芽胞杆菌BJ-10的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of Bacillus sp. BJ-10

图2 基于芽胞杆菌gyrB基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic rooted tree based on sequence analysis of gyrB gene of BJ-10 and related Bacillus strains

表1 芽胞杆菌BJ-10对不同病原菌的拮抗作用Tab.1 The antagonism of BJ-10 on different pathogen

2.3 芽胞杆菌BJ-10抗菌物质热稳定性和耐酸碱性检测结果

将芽胞杆菌BJ-10过滤后的无菌发酵液在35～121 ℃不同温度下处理，检测抗菌物质的热稳定性，结果发现无菌发酵液在不同温度处理下对V.mali均具有拮抗活性(表2)，在75 ℃以下处理，抗菌活性变化较小，85～121 ℃处理后活性开始下降，121 ℃高压处理20 min后抑菌带宽度仍能达到4.7 mm，抑菌效果为15.7%，为常温对照处理的72.3%。这说明芽胞杆菌BJ-10能分泌抗菌物质到发酵液中，抗菌物质具有较强的热稳定性。将无菌发酵液调至不同pH值处理12 h，再调回初始pH，测定抑菌活性，结果显示：经不同pH处理后的抗菌物质均保留有一定的抑菌活性(表2)，发酵液中的抗菌物质在经中性或碱性(pH=7.0和pH=9.0)处理后抑菌活性最高，但在酸性或强碱处理下，活性显著下降。

表2 不同温度和pH处理的芽胞杆菌BJ-10发酵液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性Tab.2 The antimicrobial activities to Valsa mali of BJ-10 fermentation filtrate by different temperature and different pH treating

2.4 芽胞杆菌BJ-10对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治效果

采用盆栽的方法检测了芽胞杆菌BJ-10对甜瓜白粉病的防治效果，结果显示(表3)，与空白培养基对照处理的病情指数100相比，BJ-10的5-1倍无菌发酵液处理的甜瓜白粉病病情指数为23.3，防效达到了76.7%，而5-1倍带菌发酵液防效达到了80.0%，与三唑酮农药处理防效相同。以上结果说明芽胞杆菌BJ-10的发酵液稀释5倍用能较好的防治甜瓜白粉病，且带菌发酵液处理效果更好。采用先喷雾接种生防菌和农药处理，再接种病原菌的方法检测芽胞杆菌BJ-10对甜瓜细菌性果斑病的防治效果。结果显示(表3)，芽胞杆菌BJ-10发酵液稀释5倍后对甜瓜细菌性果斑病仍有较好的防效，无菌发酵液防效达到了87.5%，而带菌发酵液为94.4%，和两种化学农药的防效相近。

表3 芽胞杆菌BJ-10对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治效果

Tab.3 The efficiency ofBacillussp. BJ-10 in prevention of melon powdery mildew and bacterial fruit blotch disease

处理病情指数防效%白粉病细菌性果斑病白粉病细菌性果斑病对照(CK)100a45.6a0.0a0.0a20%三唑酮乳油1000倍液20.0b—80.0b—新植霉素1000倍液—0.6d—98.6b农用硫酸链霉素1000倍液—0.3d—99.4bBJ-10的5-1倍带菌发酵液20.0b2.6c80.0b94.4bBJ-10的5-1倍无菌发酵液23.3b5.7b76.7b87.5c

3 结论与讨论

芽胞杆菌是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多，分布广泛，是土壤和植物微生态中的优势种群[10]。研究最多的是枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，其次为苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)，然后是蜡状芽胞杆菌(B.cereus)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、短小芽胞杆菌(B.breves)和解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)等[11-14]。本试验从北京农学院试验田菜园土壤中分离到一株生防菌BJ-10，该菌株菌落形态同芽胞杆菌形态一致。近代分子生物学技术的发展为细菌的分类与鉴定提供了高效的方法，如16S rDNA基因序列广泛应用于细菌鉴定或构建细菌的系统进化关系上，但是在亲缘关系很近的分类类群间，16S rDNA基因序列间因相似度太高难以进行区分和鉴定[15]。近年来不断有新的蛋白编码基因作为细菌鉴定标记来弥补16S rDNA序列的不足，比如DNA促旋酶B亚基编码基因gyrB[16]。gyrB基因的进化速率大于16S rRNA基因，因而也非常适合近缘种的鉴定[7]。本试验直接用gyrB基因作为BJ-10的分子生物学指标，经过序列比对和系统发育树分析初步确定BJ-10为解淀粉芽胞杆菌。然而，细菌的生理生化指标是其分类和鉴定的重要参考，因此菌株BJ-10分类地位真正的确立尚需对其生理生化特性进行确定。

芽胞杆菌能够产生多种抗菌物质，主要包括脂肽类抗生素和拮抗蛋白两大类。这些抗菌物质在拮抗病原菌和植物病害防治方面具有重要作用[6]。此外，芽胞杆菌还能通过竞争作用和诱导植物产生抗病性等机制防治植物病害[5, 6]。本试验筛选到的芽胞杆菌BJ-10对测试的9株病原真菌和1株病原细菌都具有拮抗活性，说明其能产生抗菌物质。对BJ-10的发酵液进行了不同温度和酸碱度处理，结果发现抗菌物质有较好的热稳定性和一定的耐酸碱性，而这些特性特别符合环脂肽类抗菌素的特征。芽胞杆菌产生的环脂肽类抗菌物质，如伊枯草菌素(Iturin)和泛革素(Fengycin)家族等，具有环状肽链结构的特点，赋予了其较强的抗逆性能[17]。在对甜瓜白粉病和甜瓜细菌性果斑病的盆栽防病试验中，发现了无论带菌或无菌发酵液均对甜瓜白粉病和甜瓜细菌性果斑病有较好的防效，其中BJ-10带菌发酵液防效更好，这不仅说明了BJ-10产生的抗菌物质在这两个病害防治方面起到了重要作用，还说明了BJ-10的防病作用可能还有另外的机制，比如竞争机制或诱导抗病能力等。因此，芽胞杆菌BJ-10的抗菌物质组成、竞争或诱导植物抗病机制就成为了下一步研究的重点。总之，芽胞杆菌BJ-10是一株抑菌谱广，抗菌物质稳定，具有较好的防病能力，具有巨大开发潜力的生防菌株。