一种植物根系根结染色方法的改进

冯加平，赵文超，李元慧，梁晶晶，张 旋，王绍辉,*，赵福宽

(北京农学院 a.植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室；b.生物科学与工程学院，北京102206)

根结线虫(Root-knot nematodes RKNs)是一种植物寄生性线虫，也是危害最为严重的一种植物病原性线虫。其中，因种类多，分布广，能够感染3 000多种作物，如：蔬菜类、豆科类、油料作物类及果树类等。在根结线虫属(Meloidodynidae)中，南方根结线虫(Meloidogyneincognita)是农业生产中最常见的病原线虫。据统计，全球农业栽培作物90%以上的损失全部由根结线虫病引起，每年造成作物经济损失约为＄1 180亿[1, 2]。番茄作为中国种植面积最广泛的一种栽培蔬菜之一，严重受根结线虫的侵害。南方根结线虫二龄幼虫(J2)主要侵染植株的营养根，也可侵染侧根和须根，侵染植株根尖部位后，找到合适的取食位点使周围5～7个宿主细胞发生畸变，诱导形成多核、肥大的巨细胞，巨细胞迅速膨胀，线虫附近的根组织细胞变厚，导致根部向外凸出并形成根结[3-5]。根结形成后，根尖部位继续生长，可二次受到RKN侵染，从而在根系上形成大大小小的根结，使根系呈念珠状。RKN侵染严重的植株根部呈现瘤状，根部水和营养物运输的能力丧失，植株发育受阻，植株整体长势衰退[6]。前期研究结果表明，根结的数量和大小与感染线虫的数量有关[7]，根结数量一定程度上反映出植物对RKNs的敏感性。

由于根结数量庞大，根结体积大小不均，易与根毛的突起相混淆，因此，对根结进行染色目的在于与其他根系组织相区分。据研究报道，在线虫侵染植物根尖初始阶段，用酸性品红、冰醋酸和蒸馏水配制的染液采用煮沸的方式对入侵根尖部位的J2s及根结进行染色[8, 9]，整个过程消耗时间较长，而且染料中冰醋酸刺激性气味较大。

本研究旨在将方法A进行优化后，快速、准确地区分根结与根系其他组织，提高试验效率，同时进一步证实方法I对拟南芥(Arabidopsisthaliana)和烟草(NicotianatabacumL.)植株根结染色的适用性。

1 材料与方法

1.1 植物材料

番茄野生型CM (该株系原始种子由中国科学院遗传与发育生物学研究所(北京)李传友研究员惠赠)、拟南芥和烟草。

根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)，由农业应用新技术北京市重点实验室自繁。

1.2 材料的种植与管理

番茄(基质栽培)：番茄种子在55 ℃温水中浸泡4～6 h，用3%的次氯酸钠溶液浸泡20 ～30 min，不断搅荡，无菌水冲洗3～5次，将种子整齐摆放预先铺有双层湿润滤纸(滤纸湿润无流动水)的培养皿上，做好标记。黑暗处理，催芽2～3 d。待大部分种子“露白”时立即播种于穴盘中，人工气候室中培养。气候室白天温度26～28 ℃，16 h光照相对湿度70%～80%，夜间16～18 ℃，8 h黑暗。根据番茄幼苗的生长状况，适时浇水和营养液，及时通风[10]。

拟南芥与烟草(基质栽培)：将预先置于4 ℃冰箱中保存3～4 d烟草种子和预先用70%乙醇浸泡5 min，清水冲洗3～5次后，用牙签蘸取拟南芥与云烟种子插播于穴盘，在植物气候箱培养。28 d后，将烟草幼苗移栽直径为6 cm营养钵中，转移人工气候室中培养。气候室白天温度22 ℃，16 h光照，湿度70%～80%，夜间16～18 ℃，8 h黑暗。根据幼苗生长状况，适时浇灌水或营养液，及时通风[11, 12]。

1.3 南方根结线虫接种

将试验苗盆表面基质喷洒湿润，围绕植株根部1.5 cm处打4个孔，用移液枪将预先计数的南方根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液均匀注入4个孔内，每植株接种量500头/株。接种完毕后，用基质将孔覆盖住即可[13]。

1.4 染液配制及染色方法

方法A染液配制：称量3.5 g酸性品红溶于250 mL冰醋酸中，再加入750 mL的蒸馏水混匀即可(可根据植株根系大小、多少适当配制染色)。方法I染液配制：称量3.5 g酸性品红溶于1 000 mL的蒸馏水中，混匀即可(可根据植株根系大小、多少适当配制染色)。将2种染液进行稀释，使其染色液终浓度分别为0.5 g/L和2.5 g/L。

方法A：将洗净的植株根系置于1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min后，用清水冲洗30 s以便去除根系表面残留的次氯酸钠，后蒸馏水中浸泡15 min。将根系转入盛有酸性品红的100 mL的烧杯中，煮沸1 ～ 5 min (时间根据根结上色的情况而定, 以大部分的根结被染成红色为准, 若长时间不易上色, 可再向烧杯中添加少量酸性品红溶液)，冷却后用自来水冲洗根系表面的残留的品红，然后转移到盛有100 mL酸性甘油(甘油中加几滴5 mol/L HCl)的烧杯中加热褪色0.5 ～ 1 h，根褪色即可见红色根结，根毛呈淡黄色，可进行根结数统计，并保存于甘油中。

方法I：将洗净的根系置于1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min后，用清水冲洗30 s后放入预先有蒸馏水的烧杯中浸泡15 min，除去根系表面残留的次氯酸钠溶液。晾干并将根系转入200 mL的烧杯中，加入浓度为3.5 g/L酸性品红溶液(以酸性品红溶液没过根系为准)，室温放置染色45 ～ 60 min(染色时间可随根结大小调整，以绝大部分的根结被染成红色为准)后，流水冲洗表面的品红溶液，放置于预先有蒸馏水的烧杯中褪色2～5 min，便可见根结被染成红色，其他根系为淡黄色，即可进行根结数统计，并保存于甘油中。

所有数据均采用Excel进行记录，用SPSS 13.0多重比较法进行数据的单因素方差(ANOVA, Duncan检验)进行差异显著性分析，同时采用Graphpad Prism6进行图表制作，用Photoshop软件图片处理。

2 结果与分析

2.1 番茄、拟南芥与烟草根系根结染色比较

因较小根结与根毛突起人肉眼不易区分，造成的人为统计误差较大。结果显示番茄和云烟根系根结染色前后统计数量差异显著(图1-A)。而将根结染色后，根结呈深红色，根毛浅粉红色，则便于正确区分根结(图1-E～G)。植物由于根结构的不同，烟草和拟南芥植物根系接种后RKN对其根结染色，结果与番茄类似(图1-F, G)。结果表明，在确保数据的准确性前提下根结染色后较易于观察根结。

A.不同植株根系根结数目统计；B、E.染色前后的番茄根系根结；C、F.染色前后的烟草根系根结；D、G.染色前后的拟南芥根系根结；■染色前，染色后；RH: 根毛；RK: 根结图1 不同植株根系根结数目统计及根结染色前后对比图 Note：A：Number of root-knots of different plants；B、E：Tomato roots before and after staining；C、F：Tobacco roots before and after staining；D、G：Arabidopsis roots before and after staining；■ Before dyeing， After dyeing；RK：Root-knot；RH：Root HairFig.1 Number of root-knots of different plants and morphology of root-knot before and after staining

2.2 番茄植株根系根结不同染色方法效果比较

从图2 中可以看出，与未染色根结相比，染色根结易于人肉眼观察及区分；根系根结用方法A在煮沸的方式下染色(图2-B)与方法I不经过煮沸方式染色(图2-C)相比，染色效果无差异。

A、未染色根结；B、方法A染色根结；C、方法I染色根结；D、未染色根结放大图；E、方法A染色根结放大图；F、方法I染色根结放大图图2 不同染色方法根系根结染色比较 Note：A and D.Unstained root-knots；B and E.Root-knots stained with Method A (with boiling)；C and F.Root-knots stained with Method IFig.2 Comparison of root-knot staining under different dyeing solutions

2.3 筛选最佳的染液浓度和染色时间

结果(图3、4和图5)表明，采用方法A和方法I对根结染色，随着染液浓度的增加，被染色根结所占总根结数的百分比增高，且染液浓度在3.5 g/L条件下被染色根结所占百分比达到90 %以上，且两种方法之间无明显差异(图3)；在3.5 g/L染液浓度下，方法A和方法I根结染色效果较好且无差异(图4-C,I)；而方法I 在染液浓度为3.5 g/L时，根结染色时间最长仅需45 min，便可将较大根结着色(图5-C)。

图3 两种染色方法不同染液浓度染色根结所占百分比比较Fig.3 Comparison of the percentage of root-knots stained with different dyeing concentration

A-F.不同浓度下方法A染色效果图；G-L.不同浓度下方法I染色效果图图4 不同浓度下及不同染色方式根结染色效果图 Note：A -F，Method A with different dye concentrations；G-L，Method I withdifferent dye concentrationsFig.4 Dyeing effects of root-knot staining at different concentrations of different dyes

A-C.染色时间分别为20、40、45 min 的根结染色；D-E.对应染色根结的放大图图5 不同染色时间根系根结染色对比图 Note：A-C.Root-knots were stained and photographed after 20, 40 and 45 min；D-F.partially enlarged viewFig.5 Comparison diagram of root-knots staining with different staining time

2.4 根结脱色时间比较

由结果(图6)显示，不同的脱色剂对根系根结脱色处理5 min，方法I根结脱色效果较好，根结呈红色，根系其他组织成淡黄色，区分明显(图6-C)；而方法A使用酸性甘油为脱色剂脱色7 d 便能区分根结与其他根系组织，且与方法I脱色效果相似(图6-B)。

A.方法A脱色5 min；B.方法A脱色7 d；C.方法I脱色5 min图6 染色根结不同脱色时间比较 Note：A.Decolorize for 5 min using Method A；B.Decolorize for 7 d using Method A；C.Decolorize for 5 min using Method IFig.6 Comparison of different decolorization time of root-knots

2.5 方法I在不同植株中的染色验证

由结果(图7)显示：采用方法I中所确定的最适宜的染液浓度3.5 g/L染色烟草(图7-A)和拟南芥(图7-B)根结，因根系结构不同，烟草、拟南芥根系根结染色时间相对缩短。用蒸馏水直接脱色，脱色效果较好，则进一步说明方法A进行改良后，同样适用于其他植株中。

图7 烟草、拟南芥根结脱色比较Fig.7 Decolorization of root-knots of tobacco and Arabidopsis

2.6 染色方法流程比较

流程图(图8)看出，不同的方法对根结染色，方法I与方法A相比，染液成分与脱色液相差较大，试验操作步骤简化， 试验所用时间从7 d左右缩短至1 h，大大提高了试验效率，且根结在甘油中可长期保存。

3 讨 论

本研究对酸性品红染色的染色液及脱色液配方做出了重要改良，染液中去除了冰醋酸，脱色液中直接用蒸馏水代替了酸性甘油，但同时强调为使染剂能够沉积于根系组织中，将根系保存于甘油中[14]。方法I未采用煮沸方式进行根结染色，整个根结染色(45 min)与脱色(2～5 min)所需时间相比方法A (7 d)大大缩短，但根结染色效果两者并无明显差别。此外，本研究中确定了改良后的染液及脱色液的最适的浓度、染色时间和褪色时间。方法I整个试验过程可在1 h内完成，同时不影响染色效果(图8-B)。此外，我们还测定了方法I在不同模式植物中的适用性。因此，方法I优化了染液成分、简化了操作步骤，建立了一种快速、高效、安全、可靠的植物根结染色方法。值得注意的是，由于不同植物的根结构、根体积和根结大小不同，随着根结的数量和大小的增加，染色和脱色的时间也应相应延长。

图8 两种方法染色过程流程图Fig.8 The staining processes with Method A (A) and Method I (B)

优化后的染液成分无挥发性物质，配制后可长期保存使用，方法A染液需现配现用(因冰醋酸具有挥发性)。从染料的性质来看，酸性品红(C20H17N3Na2O9S3)是一种生物染料，也是一种化学性质稳定的钠盐，对环境的危害较小。我们用不同浓度的染液对几种植物的根结染色，筛选出最适宜的染液浓度取决于植株根结数和根系结构。同时，在脱色过程中，针对植株不同根结大小、数量需要适当调整根结脱色时间，避免过度脱色，否则很难区分根结和根毛。综上所述，方法I是一种安全、高效、简便的根结染色方法，可快速判别出不同植物品种对南方根结线虫的抗性差异。