芒果苷抑制金黄色葡萄球菌诱导的细胞凋亡

王豕辰，徐 珺，董 恒，李金尧，侯晓林

(北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也称金葡菌，是革兰氏阳性菌代表，致病性仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌[1]。它可以产生多种毒力因子[2]，刺激细胞发生凋亡[3]，产生局部炎症，造成大量感染甚至威胁畜禽生命[4]。有研究表明，金葡菌通过激活细胞膜上TLR2受体，从而激活下游细胞信号通路，诱导细胞凋亡[5]。芒果苷又称莞知母宁，药理作用广泛，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等作用[6]。据报道，芒果苷可以通过抑制脑神经元细胞凋亡来减轻脑组织缺血再灌注时的损伤[7]，其还可以抑制促凋亡蛋白的表达从而保护高糖诱导的胰岛细胞损伤[8]。但是，芒果苷对金葡菌诱导的RAW264.7细胞凋亡的抑制作用及其作用机制尚少见报道。

本试验建立了金葡菌刺激后RAW264.7细胞凋亡模型，通过检测芒果苷对细胞凋亡相关因子和蛋白表达探索芒果苷是否具有抑制细胞凋亡的作用，从而为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

小鼠巨噬细胞(RAW264.7)，购自北京协和细胞资源中心；金葡菌ATCC29213购自上海北诺生物技术科技有限公司；DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco)；双抗(Gibco)；MH肉汤培养基(海博生物，中国)；甘油(索莱宝，中国)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigam,美国)；芒果苷>98%(阿拉丁，中国)；四唑盐(MTT)(Amresco，美国)；ELISA试剂盒(Raybiotech,，美国)；Caspase-3活性检测试剂盒(碧云天，中国)细胞全蛋白提取试剂盒(凯基，中国)；BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基，中国)；Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin一抗(CST，美国)；脱脂奶粉(Oxoid，英国)；Alexa Fluor 488抗兔荧光二抗(Life Technologies，美国)。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞用DMEM完全培养基培养于37 ℃、5%CO2培养箱内，根据细胞数目形态1～2 d传代1次，保持细胞处于对数生长期。

1.2.2 细菌培养 金葡菌在MH肉汤培养基中培养15 h后，10倍梯度稀释9～10次后，取100 μL涂板计数，20%甘油冻存，-80 ℃保存。

1.2.3 芒果苷对金葡菌最小抑菌浓度测定 采用国家标准方法检测[9]。

1.2.4 MTT比色法检测细胞活力 根据实验指南步骤[10]检测细胞活力。

1.2.5 金葡菌感染细胞 试验分为5组：空白处理作为对照组(C)，金葡菌感染作为模型组(SA)，芒果苷低(25 μmol/L)、中(50 μmol/L)、高(100 μmol/L)浓度预处理作为加药组。细胞以4×105个/孔铺至6孔板，置于37 ℃、5%CO2条件下培养12 h后，加入25、50、100 μmol/L 芒果苷作用1h后，以感染复数MOI=100∶1(细菌∶细胞)的比例加入金葡菌作用 4h。

1.2.6 检测Caspase 3活性 同“1.2.5”处理细胞。收集细胞，根据Caspase-3活性检测试剂盒说明书测定细胞内Caspase-3活性。

1.2.7 ELISA检测细胞因子 同“1.2.5”处理细胞。取细胞上清液，根据ELISA试剂盒说明书分别测定细胞分泌的IL-10、IL-6和TNF-α浓度量。

1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达 同“1.2.4”处理细胞。使用细胞全蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白，同时用BCA蛋白含量检测试剂盒定量所提取全蛋白的蛋白浓度。配制浓度为5%的浓缩胶和15%的分离胶。每个样品上样量为20 μg蛋白。恒压80 V，电泳120 min。湿法恒流250 mA，转膜120 min。5%脱脂奶粉封闭60 min。4 ℃孵育一抗过夜。荧光二抗避光孵育40 min。利用奥德赛双色红外激光成像系统对待测膜进行扫描、成像。使用Imgae J进行灰度值定量分析。

1.2.9 数据分析 试验结果使用SPSS18.0统计软件进行方差分析，数据是3个平行样本的平均数±标准差。

2 结 果

2.1 金葡菌最小抑菌浓度测定结果

按照国标测定方法检测芒果苷对金葡菌ATCC29213的最小抑菌浓度，结果显示，256μg/mL以下浓度的芒果苷对其不具有抑菌作用。用于后续细胞试验中的最高浓度为200 μmol/L(84.4μg/mL)，远远低于256 μg/mL。

2.2 芒果苷和金葡菌对RAW264.7细胞毒性试验结果

为了研究芒果苷和金葡菌对RAW264.7细胞的毒性，筛选芒果苷作用细胞的最适浓度和金葡菌作用细胞时间点。取不同浓度芒果苷作用细胞24 h，采用MTT法检测细胞活力，结果发现，120 μmol/L组的细胞活力明显下降，100 μmol/L以下浓度的芒果苷对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用(图 1-A)，因此后期试验选用25、50、100 μmol/L 的芒果苷对细胞进行预处理。金葡菌取不同时间点感染细胞，采用MTT法检测细胞活力，结果发现，与0 h组相比，感染4 h组细胞的活力明显下降(图 1-B)，因此用感染复数MOI=100∶1(细菌∶细胞)刺激RAW264.7细胞4 h作为细胞凋亡模型。

图1 芒果苷和金葡菌对RAW264.7细胞毒性Fig.1 Mangiferin and Staphylococcus aureus are toxic to RAW264.7 cells

2.3 芒果苷抑制金葡菌诱导细胞凋亡相关细胞因子的表达

为了检测芒果苷对金葡菌诱导RAW264.7促炎细胞因子的分泌，采用ELISA试剂盒检测IL-6、IL-10、TNF-α的表达。结果如图 2-A-C所示，与对照组(C)相比，模型组(SA)的IL-6、IL-10和TNF-α均呈现显著上调，加入芒果苷预处理后，其呈现显著下调且具有浓度依赖性。同时检测了细胞内Caspase-3的活性，结果与上述结果相同(图 2-D)。

图2 芒果苷对金葡菌侵染RAW264.7细胞引起炎症因子表达和Caspase-3活化的影响Fig.2 The effect of Mangiferin on theexpression of inflammatory factors and caspase-3 activation induced by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

图3 芒果苷对金葡菌侵染RAW264.7细胞引起细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.3 The effect of Mangiferin on the expression of apoptosis related proteins caused by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

2.4 芒果苷抑制金葡菌诱导细胞凋亡

为了进一步探讨芒果苷对金葡菌诱导的细胞凋亡的影响，采用Western blot检测与细胞凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2, Caspase-3的表达。结果如图3所示，与对照组(C)相比，模型组(SA)Bax, Caspase-3蛋白的表达量呈现显著上调，加入芒果苷预处理后，呈现明显下调且具有浓度依赖性。

3 讨 论

细胞凋亡是多种细胞因子和蛋白共同参与的生理病理过程，是细胞主动实施的程序性死亡[11]。细胞凋亡的激活包括两种途径：一种是死亡受体途径，如Fas-FasL[12]；另一种是线粒体途径[13]，如抑制细胞凋亡的基因Bcl-2等和促进细胞凋亡的基因Bax等[14]。当细胞受到外界刺激时，促炎症因子分泌增加，抗炎症因子分泌减少[15]，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，激活下游Caspase家族蛋白，Caspase家族蛋白是可以直接造成细胞凋亡的一类蛋白酶系统[16]。有研究表明，金黄色葡萄球菌可以诱导人单核细胞和中性粒细胞凋亡。

芒果苷是一种四羟基吡酮的碳糖苷，具有抗炎和抗凋亡等多种药理特性。研究证明，芒果苷可以降低肝损伤小鼠体内TNF-α、IL-6和IL-10的表达水平，从而起到缓解肝损伤的作用[19, 20]。芒果苷可以通过抑制Bax和Caspase-3发挥神经保护作用减缓创伤性颅脑损伤[21]。本研究发现，金葡菌刺激RAW264.7细胞时，细胞炎性因子IL-10，IL-6，TNF-α的分泌量明显增加，Bax，Caspase-3的蛋白表达量显著上调，而芒果苷可以显著降低其炎性因子的分泌和促凋亡蛋白的表达。

芒果苷可以通过降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达量，缓解金黄色葡萄球菌诱导的RAW264.7细胞的凋亡。