氢气影响大鼠神经兴奋传导的研究

张晓康, 仪杨, 谢飞, 张昭, 马胜男, 赵鹏翔, 马雪梅

北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124

氢气(H2)具有重要的生物学功能。1975年，Dole等[1]的研究表明，连续14 d在8.106×105Pa条件下吸入2.5% O2和97.5% H2的混合气体能够治疗小鼠皮肤鳞状细胞癌。随后在多个缺血再灌注造成组织或器官严重损伤的模型中发现，氢气能够减少氧化应激、消除炎症、降低凋亡，发挥着显著的保护治疗作用[2-3]。大量的研究先后证明氢气对逾百种疾病具有潜在治疗作用，如各类缺血再灌注损伤、动脉硬化、糖尿病、急慢性炎症等[4-6]。

目前，对于氢气发挥生物学作用的机理一直存在争议，主要有两种假说：一是被广泛接受的氢气选择性清除毒性自由基的假说；二是生物酶假说，即氢气发挥生物学作用可能主要是多靶点基于酶学反应的过程，细胞膜的氧化还原酶类及离子通道等都受到氢气的调节[7]。氢气作为理想的选择性抗氧化剂，目前对其神经功能调节作用的研究较多，如治疗神经退行性疾病、缓解毒瘾戒断症状和抗焦虑抑郁等[8-11]。用富氢水灌胃3个月能够改善阿尔默茨海默症转基因模型雌性小鼠的认知行为[8]；帕金森病人在连续饮用富氢水48周后能够明显提高帕金森评分，表明氢气能够改善帕金森病的影响[11]。研究还发现，氢气生理盐水注射能预防小鼠吗啡成瘾戒断症状，提示了氢气或许能减少戒毒痛苦，协助戒毒，而氢气在脑中的抗氧化作用可能是氢气辅助戒毒的作用机制[9]。2019年Mizuno等[10]招募志愿者，通过K6评分、血液生化指标的检测，测验氢气对正常人体的情绪、焦虑、神经自主行为和日常生活动的影响，结果表明富氢水能够降低焦虑、抑郁和神经自主功能，对神经兴奋具有一定的抑制作用而对于血压等生理指标没有影响。此外，饮用富氢水可以改善有机磷农药诱导的神经功能损伤，提高乙酰胆碱酯酶活性[12]。以上研究表明，氢气对神经功能具有调节作用，但对上述结果的分析多数是从氢气的选择性抗氧化推测，氢气对神经细胞的兴奋传导功能是否有影响还没有相关研究。

膜片钳技术利用玻璃微电极与细胞膜进行封接，对细胞膜表面的离子通道的离子电流和电导等参数进行记录和分析，在神经系统功能研究和药物研究等生理功能研究中已经有了广泛的应用[13]。动作电位是神经或者心肌细胞等可兴奋细胞受到刺激信号时在静息条件下的基础上产生的可扩布的电位变化过程，动作电位过程中包含着钠、钾、钙和氯离子等的转运和相应的离子通道的开闭，并且在不同的可兴奋细胞具有特征性的动作电位[14-16]。因此，研究神经细胞动作电位的变化是研究神经功能变化的最直接方式[17]。

本研究通过脑片膜片钳技术分别测定氢气作用于大鼠大脑切片皮层神经细胞和饮用富氢水(8周)大鼠大脑切片皮层神经细胞的动作电位，并利用液相色谱质谱联用仪(liquid chromatograph massspectrometer，LCMS)研究饮用富氢水8周后的大鼠大脑皮层神经细胞神经递质的含量，初步分析氢气影响神经兴奋传导的机制，旨在阐述氢气对神经损伤保护功能和对神经功能调节功能的可能作用机制，以期为氢气对神经相关疾病的治疗提供出发点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

大鼠(Rattusnorregicus)购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。富氢水购买自北京活力氢源饮品有限公司。所用化学试剂均为分析纯。

人工脑脊液配制：124 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1KCl、1.2 mmol·L-1NaH2PO4、24 mmol·L-1NaHCO3、12.5 mmol·L-1D-葡萄糖、2 mmol·L-1CaCl2、1.5 mmol·L-1MgSO4，pH 7.3。

电极内液配制：140 mmol·L-1葡萄糖酸钾，2 mmol·L-1MgCl2，8 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1HEPES，0.2 mmol·L-1NaGTP，2 mmol·L-1Na2ATP，pH 7.3。

膜片钳玻璃电极电阻为4～6 mΩ，由硼硅酸盐玻璃毛细管(GB 150F-86-10，美国Sutter instrument公司)拉制;Axopatch 700B(美国Molecular Devices公司)；VT1000 S震动切片机(德国Leica公司)。

1.2 膜片钳测定氢直接作用大脑皮层动作电位

1.2.1大鼠脑片制备 大鼠用乌拉坦(25%，1 mL·100 g-1)深度麻醉，断头后迅速从颅腔取出大脑。将大脑移至冰冷的人工脑脊液中冷却。随后用502胶将大脑粘于标本底座，将标本底座固定于盛有冰冷人工脑脊液的标本槽内，再用震动切片机将大脑组织横切，厚度为300 μm。制备的脑片转移至含有饱和95% O2和5% CO2混合气体的人工脑脊液孵育槽中，室温孵育至少1 h，备用。

1.2.2膜片钳测定脑片动作电位 分2瓶人工脑脊液置于37 ℃恒温水浴锅中，其中一瓶预先0.5 h通入等流速的氧气、二氧化碳和氢气至饱和并持续通入，另一瓶预先0.5 h通入等流速的氧气和二氧化碳至饱和并持续通入。将制备好的大鼠脑切片放置在记录槽内，记录槽中温度为(31±1) ℃，蠕动泵恒定速度灌流，速度为2 mL·min-1。记录槽管路首先通入充满饱和氧气和二氧化碳的人工脑脊液，膜片钳使用玻璃电极与大脑皮层区细胞进行封接，在全细胞模式下记录动作电位，刺激电流从-60 pA到500 pA(刺激时间500 ms，间隔5 s)，以20 pA增长。之后，500 pA 500 ms激发刺激动作电位。最后，-20 pA 800 ms刺激激发超极化。结果为对照组数据(CTL)。完成后切换记录槽管路持续通入充饱和氧气、二氧化碳和氢气的人工脑脊液，记录槽温度、膜片钳参数设定不变，膜片钳在全细胞模式下记录大脑皮层动作电位，结果为氢气组(H2)数据。离子电流信号通过Axopatch 700B放大，pClamp10.6软件用于记录采集。

1.3 膜片钳测定饮用富氢水8周的大鼠大脑皮层动作电位变化

1.3.1大鼠8周饮用富氢水干预 4周龄大鼠随机分成2组，每组8只，富氢水组(H2)每日提供饮用饱和富氢水2次，每次1 h(8:00—9:00，17:00—18:00)，对照组(CTL)同样时间饮用去离子水，其余时间禁水，共处理8周。

1.3.2大鼠脑片制备 经过8周处理的大鼠采用1.2.1中的方法制备大鼠脑片。

1.3.3膜片钳测定脑片动作电位 人工脑脊液置于37 ℃恒温水浴锅中，预先0.5 h通入等流速的氧气和二氧化碳至饱和并持续通入。将制备好的大鼠脑切片放置在记录槽内。记录槽管路通入充满饱和氧气和二氧化碳的人工脑脊液，膜片钳使用玻璃电极与大脑皮层区细胞进行封接，在全细胞模式下记录动作电位，记录槽温度、流速和膜片钳参数设定与1.2.2相同。

1.4 液相色谱质谱联用仪测定脑组织神经递质含量

色谱条件参照赵芳等[18]的研究。取大鼠大脑皮层精密称重，置入2 mL离心管中，按1∶9的比例加入混合溶剂(甲醇∶乙腈为1∶1，体积分数)，冰水浴快速匀浆，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析大脑皮层中谷氨酸(glutamate，Glu)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)和乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)含量。

1.5 数据分析

利用pClamp10.6软件记录的动作电位原始数据和离线分析动作电位参数为：静息膜电位(Vm)，阈值电流(rheobase)，阈值电压(threshold)，峰高(peak amplitude)，半峰宽(halfwidth)，动作电位间隔(inter spike interval)，爆发频率(number of action potential)，快后超级化电位(fAHP)，慢后超级化电位(sAHP)，输入抗阻(Rin)。利用Graphpad prism 7进行数据分析，所有数据以均值±SEM表示。统计采用非配对t-test和配对t-test，若P<0.05，即认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 氢瞬时作用对大鼠大脑皮层神经细胞动作电位的影响

氢气对神经功能具有一定的影响，为了分析氢气是如何影响神经细胞的功能，采用膜片钳技术来研究氢气是否调节神经的兴奋传导功能。如图1所示，大脑皮层神经细胞爆发动作电位的阈值电压显著升高(P=0.029 2)，表明神经细胞爆发动作电位需要更高的能量，并且动作电位间隔显著延长(P=0.030 9)，这2个因素表明神经细胞爆发动作电位的频率出现了降低趋势，氢气对神经兴奋具有一定的抑制作用。此外，神经细胞的输入抗阻显著降低(P=0.035 1),表明氢气处理过的神经细胞兴奋性出现了明显的降低。神经细胞在不同电流刺激条件下氢气处理组(H2)动作电位出现次数明显的少于对照组(CTL)，也表明氢气直接作用于神经细胞降低了神经的兴奋性。同时，神经细胞的静息膜电位出现升高趋势(P=0.098 7)，这暗示氢气可能通过改变细胞膜内外电位或者离子通道等的变化实现对神经传导的影响。

注：*—氢气处理组(H2)和对照组(CTL)间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。

2.2 饮用富氢水8周对大鼠大脑皮层神经细胞动作电位的影响

为了进一步验证相对长时间的氢处理是否能够改变脑神经细胞的兴奋性，采用4周龄大鼠连续饮用富氢水8周后，取对照组(CTL)和饮用富氢水组(H2)大鼠制备脑片，采用膜片钳技术记录对照组(CTL)和饮用富氢水组(H2)大脑皮层神经细胞的爆发动作电位情况。如图2所示，饮用富氢水组(H2)大鼠动作电位在不同电流刺激下同样出现了次数明显降低，表明在大鼠在8周相对较长的时间内富氢水干预同样降低了神经的兴奋性。皮层神经细胞的阈值电流(P=0.537 8)和动作电位间隔(P=0.385 5)具有升高趋势，表明饮用富氢水使大鼠的大脑皮层神经细胞在一定程度上升高了动作电位出现所需要的能量，进而降低了神经细胞的兴奋性。

图2 饮用富氢水8周对大脑皮层神经细胞兴奋传导的影响Fig.2 Effect of drinking hydrogen for eight weeks on excitatory conduction of cortical nerve cells

2.3 饮用富氢水8周对大鼠大脑皮层神经递质含量的影响

为了验证饮用富氢水8周后大鼠皮层神经细胞出现神经兴奋降低是否是由氢影响神经细胞合成神经递质含量变化所导致，采用LCMS检测饮用富氢水8周后皮层区细胞神经递质含量。如图3所示，与CTL组相比，富氢水组(H2)大鼠大脑皮层神经递质谷氨酸(Glu)(P=0.600 9)、γ-氨基丁酸(GABA)(P=0.713 1)和乙酰胆碱(Ach)(P=0.854 1)呈下降趋势，但差异不具有统计学意义；去甲肾上腺素(NE)(P=0.940 1)未出现明显的变化。结果表明，氢气降低皮层神经细胞的兴奋性的作用不是通过改变神经递质的合成量来实现的。

图3 饮用富氢水8周对大脑皮层神经递质含量的影响Fig.3 Effect of drinking hydrogen for eight weeks on excitatory conduction of cortical nerve cells

3 讨论

氢气是一种具有重要生物学功能的分子，在神经退行性疾病、肿瘤、脑缺血再灌注损伤等的治疗中具有明显的效果[19-21]。本研究发现氢气直接作用于神经细胞显著升高了阈值电压、延长动作电位间隔并显著降低了输入抗阻，并且在不同电流刺激下动作电位频率明显下降，表明氢气直接作用于神经细胞能够降低兴奋传导。在富氢水干预8周的大鼠皮层神经细胞在动作电位的阈值电压、动作电位间隔和输入抗阻等并没有显著性差异，但是同样出现了不同电流刺激下动作电位频率明显下降。然而，进一步LCMS检测结果表明，皮层神经递质含量并未出现显著性变化，表明氢气可能是直接作用于神经膜上离子通道或者膜内外电压差。

目前，对于氢气对神经功能的作用机制知之甚少，已报道的文章中介绍了氢气对神经细胞具有明显保护或者调节等功能，推测氢气发挥功能的原因是氢气的选择性抗氧化等[21]，但是并未解释清楚氢气是如何发挥作用，因此在本研究中通过膜片钳技术直接检测神经细胞动作电位的变化，来分析神经细胞功能的变化。

本研究脑片膜片钳的结果显示，氢气处理组与对照组相比大鼠皮层神经细胞的阈值电压、动作电位间隔和输入抗阻具有显著性差异(P<0.05)，氢气处理组静息膜电位升高，神经细胞爆发动作电位的电压阈值升高，表明氢气可能对神经细胞膜离子通道的开放和关闭有影响，很有可能是通过改变细胞内外电荷差异变化或者直接作用于细胞的膜表面的离子通道来实现对神经细胞兴奋性的调节。神经组织在紊乱状态下的异常放电和神经损伤的过程中伴随着离子的异常流动和分布，氢气对神经细胞的细胞膜表面离子通道或者膜电位的调节作用，可能是氢气缓解成瘾戒断症状、抗焦虑抑郁和改善睡眠的可能原因[9-10]。这为氢气治疗焦虑、癫痫和戒毒等神经兴奋相关疾病提供了依据。

在静息条件下，维持细胞膜两侧的离子差主要依靠离子泵钠离子、钙离子、氯离子的主动转运运输功能，其中钠-钾泵将钾离子运输至胞内，将钠离子运出胞外，维持外正内负的电位差，是维持静息膜电位主要作用[17]。本研究中，氢气瞬时作用升高了静息膜电位，很可能和钠-钾泵有关。而在神经细胞静息电位的基础上产生动作电位的过程中，伴随着多种离子通道的开闭和离子的转运。在去极化、复极化和后电位过程中主要包含着钠离子通道、钾离子通道开放和关闭[15]。本研究中，氢气处理组和富氢水组的动作电位次数均明显少于对照组，进一步说明氢气能够起到抑制神经兴奋的传导的功能可能和钠离子通道、钾离子通道存在作用关系。此外，GABA受体和甘氨酸受体是神经系统最重要的2种配体门控氯离子通道，起到对神经兴奋的抑制作用[22]。本研究中，LCMS检测结果表明，富氢水组的GABA相对含量略低于对照组，因此，氯离子通道也可能是氢气发挥抑制性作用的位点。

值得注意的是，本研究中，饮用饱和富氢水8周大鼠的大脑切片在动作电位指标中出现了抑制趋势，但神经递质含量未发生显著性变化。这可能是因为富氢水在制备饱和后会在10 min中内迅速挥发，在室温常压条件下15 min将至饱和浓度一半左右，约400 μmol·L-1，进而导致饮用富氢水作用相对不显著。因此在后续研究中，可将饮用富氢水代替为吸入固定浓度的氢气，保证氢气的充分作用。此外，本研究证明氢气对神经兴奋的抑制作用可能是通过影响离子通道，因此，下一步研究将通过膜片钳技术独立研究氢气对钠、钾和氯离子通道的影响。