胶原诱导性关节炎发生后不同时间大鼠骨骼的变化

陈文双 许碧莲 林长缨 田佳 张新乐

(1广东医科大学，广东 湛江 524023；2广东医科大学附属医院)

类风湿关节炎(RA)可导致不可逆的关节破坏、畸形，甚至残疾、死亡。RA在疾病发展和治疗过程中容易并发骨质疏松(OP)〔1〕。

OP是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。RA伴有两种形式的OP，一种是关节周围的骨质丢失，另一种是全身性OP。RA的动物模型有多种，其中较为经典的是弗氏完全佐剂(IFA)诱导性关节炎和Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎(CIA)大鼠模型，而CIA大鼠模型在病理学上的变化，更接近人类的类风湿关节炎〔2〕。本研究旨在探讨CIA发生后不同时间大鼠骨骼的变化。

1 材料和方法

1.1实验动物 8周龄雌性SD大鼠70只，购自广东省医学实验动物中心，体质量(164±20) g。

1.2药品及仪器 牛源性Ⅱ型胶原蛋白购自四川大学，IFA购自美国Sigma 公司。viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)，双能X线骨密度仪(Hologic，Inc，USA)，858 Mini Bionix型材料测试机及测试系统(MTS，美国)。

1.3CIA模型建立及分组〔3〕随机取24只大鼠作为对照组，46只用于建立CIA模型。暴露大鼠背部皮肤，取配制好的Ⅱ型胶原蛋白乳剂(1.5 g/L)，在脊柱两旁皮内多点注射，每只注射乳剂0.4 ml。1 w后，加强免疫1次。正常对照组按相同方法注射0.05 mol/L醋酸0.4 ml。自初次免疫3 w后筛选出成功发生关节炎(两后肢关节炎指数≥4)的大鼠24只为CIA组，然后在CIA发生后4、8、12、16 w随机处死6只取材。

1.4病理组织学检查 取右踝关节进行固定、脱钙、包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色后在显微镜下观察组织病理变化，进行病理学评分统计〔4〕。

1.5Micro-CT测量 将右侧股骨沿长轴置于固定器内，使各样本放置的角度保持一致。采用viva Micro-CT 40对股骨进行扫描，对选定股骨距生长板远端1.0 mm、层厚3.0 mm的松质骨为兴趣测量区域进行图像分析，得到骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、连接密度(Conn.D.)、结构模型指数(SMI)、体积骨密度(vBMD)等定量参数〔5〕。

1.6骨密度(BMD)及骨生物力学检测〔6〕将测完micro-CT的右侧股骨用双能X线吸收法(DXA)BMD仪测出骨矿含量(BMC)和骨面积(area)，然后用BMC/area进行计算，即可算出面积骨密度(aBMD)。

将测完BMD的股骨置于(MTS)试验机上，测试采用三点弯曲法，用1 mm直径的压头，跨距(L)为15 mm，加载速度为0.01 mm/s。仪器即时记录每个时刻点的载荷和桡度变化值，再进一步换算得每个时刻点的应力和应变值，绘制应力-应变曲线，从曲线上直接获取或依公式计算出最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚度等参数。

1.7统计学分析 采用SPSS17.0软件进行方差分析。方差齐时采用LSD 检验；方差不齐时采用Tamhane检验。

2 结 果

2.1各组踝关节病理学评分的变化比较 与对照组比较，CIA组CIA发生后4、8、12、16 w踝关节病理学评分明显增加(P<0.01)。见表1。

表1 各组踝关节组织病理学评分的变化分)

2.2各组大鼠股骨骨密度的变化比较 与对照组比较，CIA组CIA发生后4、8、12、16 w股骨aBMD和vBMD均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组股骨骨密度比较

2.3各组大鼠股骨生物力学参数的变化 与对照组比较，CIA组CIA大鼠发生后4、8、12、16 w股骨生物力学参数最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚度均明显降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠股骨生物力学参数的变化比较

2.4各组大鼠股骨松质骨Micro-CT定量参数的变化 正常大鼠可见清晰的关节腔，滑膜组织无炎性细胞浸润，无纤维组织增生，关节软骨表面光滑，软骨细胞分布均匀，骨纤维排列整齐。CIA发病大鼠软骨表面完整性遭破坏，细胞分布不规则；可见软骨细胞增生，软骨和滑膜层粘连、纤维化；并有形成肉芽组织和血管翳。与正常对照组比较，CIA大鼠发生后4、8、12、16 w股骨松质骨Micro-CT定量参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均减少(P<0.01)，而Tb.Sp、SMI均明显增大(P<0.01)。见图1，表4。

图1 各组大鼠股骨远端Micro-CT的三维图

表4 各组大鼠股骨远端Micro-CT定量参数的变化

3 讨 论

通过踝关节组织切片可观察到：本研究中踝关节组织切片病理改变与RA临床上出现的关节肿胀，滑膜充血、水肿，组织疏松，滑膜组织的不规则增厚和关节软骨破坏等基本相似。本研究结果说明CIA大鼠在病理学表现上与人类RA相似，提示本实验成功建立了CIA大鼠模型。随着CIA发病时间的延长，大鼠踝关节的病理改变更加明显。

本实验采用Micro-CT对股骨远端松质骨进行三维重建分析，通过Micro-CT直接观察松质骨的骨小梁形态、结构及三维结构，并获得骨小梁的立体测量学的指标。Micro-CT比二维体视学定量方法更准确、更科学、更全面反映骨组织结构，能获得真正的各项同性的容积图像，提高空间分辨率〔7〕。SMI是用于评价骨小梁的结构形态，反映骨小梁杆状和板状的程度，理想板状结构为0，理想杆状结构为3，OP时，SMI数值增加，表明骨小梁由板状转变为杆状。Tb.Sp是指骨小梁之间的平均距离，反映骨小梁的结构形态。Tb.Sp越大，表示骨小梁距离越大，OP越明显。本实验结果提示随着CIA发病时间的延长，大鼠股骨松质骨的骨丢失及骨三微结构破坏越严重。

BMD的测定可作为OP的诊断、骨折发生的危险性的预测及药物疗效的评价的指标之一〔8〕。BMD有aBMD和vBMD的表达方式。aBMD是利用DXA测出BMC和area，然后BMC除以area得出BMD，也就是常用的BMD。DXA BMD仪测定BMD具有高精度、无创伤、快捷等优点，在临床上广泛应用，但是由于骨的厚度没有得到校正，不能排除骨大小对BMC的影响。因此，有学者认为BMD反映的并不是真正的BMD，仅是一个二维的估计值〔9〕。vBMD是通过Micro-CT对股骨进行三维扫描，获得骨骼的体积(V)和BMC，BMC除以V即获得vBMD。vBMD排除了骨大小的影响，更真实反映BMD〔10〕。本研究结果提示CIA大鼠发生后4 w开始出现股骨骨质量下降，骨折发生危险性增加。vBMD的结果变化与踝关节病理学评分、骨量的变化基本一致，说明vBMD比aBMD更真实反映BMD。提示随着CIA发病时间的延长，大鼠股骨vBMD的降低越明显。文献报道，RA病人早期就出现BMD降低，但BMD流失与关节炎的持续性并没有相关性〔11〕。股骨颈BMD的减小是RA疾病特征之一，股骨颈BMD不仅是一个全身性骨质疏松的指标，也是系统评价RA病人的一个指标，还可以有效衡量RA治疗和康复情况〔12〕。

骨生物力学是以工程力学为基础，研究骨组织在外界作用下的力学特性和骨组织在受力后的生物学效应，是对骨质量进行评定的一种可靠手段。本实验结果提示CIA发生后4 w大鼠开始出现股骨的生物力学性能降低，骨质量下降，使其在遭受外力的情况下本身的抵抗性能减弱，易于发生骨折。随着CIA发病时间的延长，大鼠股骨生物力学性能的降低越严重。

综上，CIA发生后4 w大鼠开始出现股骨松质骨的骨量减少，骨三维结构破坏，BMD下降，骨生物力学性能降低，说明CIA发生后4 w大鼠开始出现OP，而且随着CIA发病时间的延长，大鼠发生的OP越严重。临床研究显示，68%的RA患者在患病第一年就会出现骨质丢失，骨量的丢失与关节进展性损害相关〔13〕。此外，研究报道，随着患者年龄、病程及 DAS28 评分增高，患者发生 OP 的风险也增加。随着RA病程的延长，患者并发OP的发病率明显高于健康人群，而且OP的病情不断加重，更容易导致脆性骨折〔14〕。