穴位敷贴剂对糖尿病模型小鼠的血糖影响*

吴淑熔，周 雄，米长忠，何丽芳，张佳怡，李 媚，谭乐乐

(1.吉首大学，湖南 吉首 416000；2.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 吉首 427000)

中国目前是全球糖尿病患者第一大国，糖尿病日益危害着人们的健康[1]。根据国家卫健委等权威部门统计表明，近几年糖尿病患病率增速迅猛，并且呈现年轻化趋势。防治糖尿病，刻不容缓。临床在治疗糖尿病及其并发症上的药物以及给药途径方面的研究不断扩展与深入[2]。西医治疗副作用大，因此中医药的优势日渐显现，中医外治法治疗糖尿病及其慢性并发症应用广泛[3]，其中中药穴位敷贴疗法利用中药渗透药性刺激穴位来治疗糖尿病，是融合药物、穴位、经络为一体的独特疗法。目前，已经有穴位敷贴疗法应用于2型糖尿病取得显著疗效[4]。本课题组依据中医理论自创方，经动物实验研究证实其对2型糖尿病有一定的治疗作用。本实验旨在观察黄荆条等中药穴位敷贴剂对2型糖尿病模型小鼠的血糖变化的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 动物与饲料

SPF级昆明小白鼠50只，体重18 g～22 g，雄性，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(湘)2014-0011；A级大小鼠饲料14 kg，合格证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 实验药物

黄荆条果实采自湘西吉首市的山坡路旁或灌木丛中，秋冬成熟季节采摘，由吉首大学生物资源与环境科学学院张代贵老师鉴定；党参、肉桂、黄芪、细辛、冰片、当归、怀牛膝、丹参、延胡索、川芎等购自吉首市华康门诊药店，均符合国家中药临床应用标准。

1.1.3 试剂与仪器

四氧嘧啶(美国Sigma公司，批号：A7413)；血糖试纸，血糖仪(三诺生物传感技术股份有限公司，生产批号：2400053)；生理盐水(湖南金建药业有限责任公司，生产批号：H43020321)；柠檬酸、柠檬酸钠；无菌注射器1 mL；电子万用炉；电热恒温水箱HH·W 21·420型；烧杯25 mL、1 000 mL；棕色玻璃瓶；分析天平；超微粉末粉碎机；医用胶布；pH试纸。

1.2 实验方法

1.2.1 中药穴位贴敷剂的制备

250 g黄荆条果实倒入1 000 mL蒸馏水浸泡20 min，加热至沸50 min，第二次加蒸馏水200 mL后加热至沸30 min，过滤掉黄荆条果实滤渣，得840 mL水提液，采用水浴蒸发法浓缩得黄荆条提取物3.877 g。将党参、肉桂、黄芪、细辛、冰片、当归、怀牛膝、丹参、延胡索、川芎等药材净选，置40 ℃～60 ℃低温干燥后，超微粉末机粉碎成超微粉末，真空包装。将各药物粉末按比例用姜汁混合涂于绵纸上成直径5 mm的圆饼。

1.2.2 1 %四氧嘧啶柠檬酸缓冲液

用柠檬酸(FW:210.14)2.1 g加入双蒸水100 mL中配成A液，柠檬酸钠(FW:294.10)2.94 g加入双蒸水100 mL中配成B液。用时将A、B液按一定比例混合(1∶1.32)，pH计测定pH值,调节pH=4.2～4.5,即是所需配置四氧嘧啶的柠檬酸缓冲液。根据造模小鼠总体质量算得所需四氧嘧啶的重量，按1∶100的比例加入配置好的柠檬酸缓冲液，即为1 %四氧嘧啶柠檬酸缓冲液。

1.2.3 糖尿病模型的建立

将50只小鼠分笼饲养在20 ℃～25 ℃的动物房内，明暗各12 h，自由饮食饮水，观察小鼠情况及时调整，先经5 d适应性饲养称量并记录体重，经过禁食后测量并记录血糖数据。从50只小鼠中随机抽取5只小鼠作为空白对照组，给予普通饲料喂养。将剩余45只小鼠，禁食不禁水18 h，腹腔注射1 %四氧嘧啶柠檬酸缓冲液，剂量160 mg/kg，造模3 d，禁食8 h后，尾静脉取血测血糖值，选择血糖值≥11.1 mmol/L的小鼠[5]。

1.2.4 动物分组

造模成功的27只小鼠随机分为五组，分别为阴性对照组5只小鼠、阳性对照组5只小鼠、实验组低剂量组5只小鼠、中剂量组7只小鼠、高剂量组5只小鼠。

1.2.5 实验给药

在建模成功第7天，取小鼠足三里(双)、肾俞(双)、神阙穴。穴位的选取参照《实验针灸学》常用动物针灸穴位及图谱[6]。将小鼠穴位上的毛用脱毛剂脱掉，然后敷贴药物。低剂量组：黄荆条、肉桂、丹参、黄芪等中药以1.35 g/kg剂量敷贴；中剂量组：黄荆条、肉桂、丹参、黄芪等中药以2.7 g/kg剂量敷贴；高剂量组：黄荆条、肉桂、丹参、黄芪等中药以5.4 g/kg剂量敷贴。阳性对照组：党参、当归、怀牛膝、延胡索、川芎、细辛、冰片等中药[7]以中剂量敷贴；空白组：不做任何处理；阴性对照组：敷贴棉花作为安慰敷贴剂。根据成人常规剂量以体表面积换算成小鼠给药剂量为低剂量，以该剂量的2倍、4倍剂量分别为中剂量、高剂量(低剂量：1.35 g/kg，中剂量：2.7 g/kg，高剂量：5.4 g/kg)，其中中剂量2.7 g/kg相当于临床等效量[8]。每日给予足量食量和水量，定时敷贴，1次/d，每次敷贴4 h，连续给药21 d，用医用胶布固定。

1.2.6 指标测定

体重：分别于第7天、第14天、第21天对每只小鼠的体重进行称重；血糖浓度：分别于第7天、第14天、第21天给药后禁食4 h，用小鼠尾静脉取血法，快速血糖测定仪测定。

1.2.7 统计学方法

2 结果与分析

2.1 不同穴位敷贴剂对糖尿病模型小鼠体重的影响

造模成功后各给药组小鼠连续给药21 d后，除阴性对照组小鼠平均体重逐渐下降外，其他均有所增加。空白组小鼠平均体重增长是正常喂养的结果；低、中剂量组小鼠平均体重在给药7 d后下降,14 d、21 d缓慢上升，增加但不太明显；阳性对照组小鼠平均体重有明显呈逐渐增加的趋势。在给药14 d后阴性对照组与空白组比较呈显著性差异(P<0.01)，低、中剂量与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；给药21 d后阴性对照组与空白组比较仍呈显著性差异(P<0.01)，阳性对照组、低、中剂量与阴性对照组比较均呈显著性差异(P<0.01)。从体重一指标观察说明所给的穴位敷贴剂对糖尿病小鼠体重有一定影响。见表1。

表1 穴位敷贴剂对糖尿病小鼠体重的影响

2.2 不同穴位敷贴剂对糖尿病模型小鼠空腹血糖的影响

各组小鼠造模前血糖均为正常，无显著性差异。小鼠腹腔注射四氧嘧啶后，空腹血糖浓度明显升高，与空白组相比有显著性差异。从给药7 d开始，阳性对照组及低、中剂量组小鼠空腹血糖均逐渐下降，但仅低剂量组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。给药14 d和21 d，除了空白组和阴性对照组小鼠，其他小组小鼠的血糖均值逐渐下降，各组内比较，差异有统计学意义(P<0.05)。给药14 d，阳性对照组、低剂量组小鼠空腹血糖与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。到给药21 d，阳性对照组和低、中剂量组小鼠空腹血糖与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中阳性对照组与阴性对照组比较，有显著性差异(P<0.01)。见表2。

表2 穴位敷贴剂对糖尿病小鼠空腹血糖浓度的影响

3 讨 论

3.1 四氧嘧啶制备Ⅱ型糖尿病模型

四氧嘧啶能够选择性地破坏胰岛β细胞，造成胰岛素的合成分泌功能障碍，进而引发糖尿病。本实验采用腹腔注射四氧嘧啶制备Ⅱ型糖尿病小鼠模型。四氧嘧啶毒性大，小鼠腹腔注射后，小鼠的行动变得迟缓，部分小鼠心跳加快，饮食减少，死亡量较大。实际上建模成功，使小鼠具备多饮多食，体重下降，高血糖等糖尿病的主要特征。在此模型上，观察黄荆条穴位敷贴剂对糖尿病小鼠血糖的影响。实验结果表明，黄荆条穴位敷贴剂可降低四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠血糖水平。本实验高剂量组小鼠因抓取不当、敷贴时医用胶布过多过紧等原因导致死亡。实验研究有不足之处，还需改进完善。

3.2 穴位敷贴剂对糖尿病小鼠体重的影响

阴性对照组小鼠的体重逐渐下降，说明了本实验糖尿病模型成功建模，小鼠有了“三多一少”的临床症状。从低剂量组小鼠的均值体重来看，给药前低剂量组小鼠体重明显高于其他组，这说明随机分组出现分配不均的问题。在本实验给药治疗后，低、中剂量组小鼠体重回升不明显，而阳性对照组小鼠体重在逐渐上升，两者对比观察说明所给的黄荆条敷贴剂在外贴治疗过程中改善体重下降的效果不及阳性对照组的药物。穴位敷贴在给药21 d 后阳性对照组、低、中剂量与阴性对照组比较呈显著性差异(P<0.01)，说明穴位敷贴在改善小鼠体重方面的疗效较慢。

3.3 穴位敷贴剂对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

从实验结果来看，连续给药后7 d、14 d、21 d后，实验四组里除了阴性对照组，其余三组小鼠的空腹血糖值均明显低于给药前，治疗前与治疗后比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明本实验的中药穴位敷贴剂对糖尿病小鼠模型有一定的降糖作用。在本实验中，治疗14 d、21 d后，阳性对照组和中剂量组小鼠空腹血糖与阴性对照组比较差异才陆续有统计学意义(P<0.05)，说明不同中药、不同剂量对小鼠产生作用的速度不同。治疗21 d 后阳性对照组与阴性对照组比较呈显著性差异(P<0.01)，说明阳性对照组的中药敷贴剂治疗效果优于黄荆条中药敷贴剂。结果表明，自拟方黄荆条中药敷贴剂的组方配伍仍需进一步改善研究，加强其降低血糖水平的作用。

3.4 中药穴位敷贴的效应

穴位敷贴疗法是在中医整体观念指导下，间接发挥药物对机体特定部位的刺激、直接发挥药物渗透皮肤进入血液循环到达脏腑经气作用[9]。其药物外治，不经过肝脏代谢，安全可靠；药剂量小、简易便捷。

3.4.1 药物特异性

糖尿病在中医学属“消渴病”范畴，素体阴虚，阴阳失调而阴损过多、阴虚燥热，则患者出现多饮、多食、多尿、形体消瘦的症状。本实验所用的中药均根据中医理论结合其有效的降糖作用配伍而成。黄荆条味辛、苦、性温，归肺、胃、肝经；在湘西民间，使用黄荆条果实泡茶治疗糖尿病具有一定的疗效，基础实验研究初步判定黄荆条果实对血糖浓度有一定的降低作用[10]。肉桂味辛、甘、性大热，归肾、脾、心、肝经，能引火归元制消渴上浮虚火，也可以益火之源资阴阳虚损，肉桂治疗2型糖尿病不论理论基础还是临床研究都表明其具有降糖的作用[11]。丹参味苦，性寒，归脾、肝、肾经，有活血祛瘀、清心除烦功效；黄芪味甘、性微温，归肺、脾、肝、肾经，有补气升阳、益卫固表功效；丹参与黄芪在治疗糖尿病组方中相须相使，高频使用，两者合用补泻兼施，补气行血，活血化瘀，共同治疗糖尿病[12]。

3.4.2 穴位特异性

穴位敷贴疗法作为中医特色疗法，临床上治疗糖尿病有显著疗效。足三里是足阳明胃经的合穴，具有调理脾胃、补中益气等功效；肾俞是肾的背俞穴，属足太阳膀胱经，具有益肾助阳、强腰利水等功效。根据谢瑞仁的消渴病选穴规律文献研究[13]表明，足三里、肾俞使用频率高，两穴均为消渴病常用穴位，治疗时疗效是循腧穴-经络-脏腑起作用，因此取足三里、肾俞调节脏腑、益气扶正。神阙穴位于脐中，是任脉上的阳穴，具有温阳救逆、利水固脱的功效；脐部特殊的位置是人体渗透性最强的位置，应用中药敷贴经皮吸收并刺激穴位，通过经络去调节脏腑，平衡阴阳起到治疗疾病作用[14]。

3.5 实验检测指标展望

在实验设备条件允许下，本实验仅采用小鼠体重和血糖值作为检测指标进行实验研究，实验结果得出黄荆条、肉桂等中药敷贴剂对糖尿病小鼠模型有一定的降糖作用的结论，今后还可对其血脂、HbA1c、GHb、血清胰岛素等指标进行研究观察。

3.6 民间中医药发展

实验组所用的中药敷贴剂为自拟方，方中君药为湘西民间中医药——黄荆条果实提取物。黄荆条果实在湘西普遍，可就地取材。黄荆条应用于2型糖尿病有一定的防治作用[15]，但未知黄荆条果实里起到降糖作用的有效成分，不论是黄荆条的果实、枝叶、根茎都可以进一步拓展研究。挖掘民间中草药，开发新的治疗糖尿病的药物，具有推广价值。

3.7 总 结

临床上中药穴位敷贴剂通常作为辅助治疗手段联合其他药物共同治疗糖尿病，而本实验单用穴位敷贴剂降低糖尿病动物模型的血糖，凸显了单一疗法治疗糖尿病也是有效的。经过实验结果表明，黄荆条、肉桂等中药制成的敷贴剂对糖尿病小鼠的血糖确实有影响，用于治疗糖尿病得到初步验证。今后可以改善实验方案，充实样本数量，并延长治疗周期，提高敷贴剂制备工艺，继续探索缓解高血糖的治疗手段。