黄连素联合miR-19b-3p调控阿尔茨海默病的实验研究

岳霞 孙雅丽 杨小敏 宋海燕 贺雯

阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，β淀粉样蛋白(β amyloid，Aβ)聚集及细胞内的Tau蛋白的磷酸化是其主要病理改变[1]。根据Aβ毒性蛋白的发病机制，研发靶向Aβ的治疗药物，以期为AD靶向药物的研发提供新的方向[2]。黄连素，又称小檗碱(berberine，BR)是从黄连中提取的一种天然的异喹啉类生物碱，研究表明，黄连素具有抗炎、抑制胆碱酯酶活性、抑制Aβ蛋白聚集和Tau蛋白的过度磷酸化等作用[3]。研究报道黄连素可增强胆碱能神经传递，改善脑血流量，保护神经元免受炎症，限制Tau的过度磷酸化并促进β-淀粉样肽清除[4]。黄连素能明显改善APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力，减少Aβ42的表达和老年斑的形成[5]。但黄连素对阿尔茨海默病影响的机制还尚不清楚。研究表明miRNA参与神经退行性疾病的发生发展过程，与AD的发病有关[6]。研究报道AD患者中miR-19b-3p表达水平降低，miR-19b-3p的血清水平是AD的有用生物标志物[7]。高表达miR-19b-3p可能通过调节BACE1的表达改善AD患者的认知功能[8]。因此，本实验通过用Aβ处理PC12细胞，建立AD细胞模型，研究黄连素对AD细胞模型的影响及其是否与miR-19b-3p有关。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞购自上海冠导生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自广州弗尔博生物科技有限公司；β淀粉样蛋白(β Amyloid，Aβ)购自武汉纯度生物科技有限公司；黄连素购自厦门研科生物技术有限公司；细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自杭州仟诺生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；实时荧光定量PCR检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 细胞处理与分组

1.2.1 将PC12细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中在37℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，10 μmol/L的Aβ处理建立阿尔茨海默症模型细胞，记为Aβ组，无任何处理的细胞作为对照(NC)组；分别用0.1、1.0、10.0 μmol/L黄连素和10 μmol/L的Aβ处理PC12细胞，记为0.1 μmol/L 黄连素+Aβ组、1.0 μmol/L 黄连素+Aβ(黄连素+Aβ)组、10.0 μmol/L黄连素+Aβ组。

1.2.2 将miR-NC、miR-19b-3p转染至PC12细胞后再用10 μmol/L的Aβ处理，记为miR-NC+Aβ组、miR-19b-3p+Aβ组；将miR-NC、miR-19b-3p转染至PC12细胞后再用1.0 μmol/L 黄连素和10 μmol/L的Aβ处理，记为黄连素+miR-NC+Aβ组、黄连素+miR-19b-3p+Aβ组。

1.3 CCK-8检测细胞增殖 选择各组转染后培养48 h的细胞，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞450 nm波长处的吸光度值(OD)。以OD值代表细胞增殖活性。

1.4 蛋白质印迹(Western Blot)法检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照40 μg/孔上样蛋白，经SDS-PAGE、转膜、封闭后，洗膜，加入稀释好的一抗(1∶500稀释)，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，加入按照1∶3 000稀释的HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，与500 μl的结合缓冲液混匀。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-19b-3p表达水平 各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR-19b-3p以U6为内参，miR-19b-3p上游引物序列：5’-GTGCAAATCCATGCAAAACTGA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTGCT-3’；U6上游引物序列：5’-TCGGCAGCACATATACTAA-3’，下游引物序列：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’。

2 结果

2.1 不同浓度黄连素对Aβ处理PC12细胞增殖的影响 与NC组比较，Aβ组细胞OD值和CyclinD1表达水平显著降低(P<0.05)；与Aβ组相比，不同浓度黄连素组细胞OD值和CyclinD1表达水平显著升高(P<0.05)。见表1，图1。

表1 不同浓度黄连素对Aβ处理PC12细胞增殖的影响

图1 Western Blot检测CyclinD1蛋白的表达

2.2 黄连素对Aβ处理PC12细胞凋亡的影响(黄连素：1.0 μmol/L ) 与对照组比较，Aβ组Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与Aβ组比较，黄连素+Aβ组Cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

图2 黄连素对Aβ处理PC12细胞凋亡的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡;B Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表2 黄连素对Aβ处理PC12细胞凋亡的影响

2.3 黄连素对miR-19b-3p表达的影响 与对照组相比，Aβ组miR-19b-3p表达水平显著降低(P<0.05)；与Aβ组相比，黄连素+Aβ组miR-19b-3p表达水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 黄连素对miR-19b-3p表达的影响

2.4 miR-19b-3p对Aβ处理PC12细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，Aβ组miR-19b-3p表达水平显著降低，CyclinD1表达水平显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞OD值显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与miR-NC+Aβ组相比，miR-19b-3p+Aβ组miR-19b-3p表达水平显著升高，CyclinD1表达水平显著升高，Cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞OD值显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

图3 Western Blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表4 miR-19b-3p对Aβ处理PC12细胞增殖和凋亡的影响

2.5 黄连素联合miR-19b-3p对Aβ处理PC12细胞增殖和凋亡的影响 与黄连素+Aβ组和黄连素+miR-NC+Aβ组相比，黄连素+miR-19b-3p+Aβ组miR-19b-3p表达水平显著升高，CyclinD1表达水平显著升高，Cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞OD值显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表5，图4。

图4 Western Blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表5 黄连素联合miR-19b-3p对Aβ处理PC12细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

有研究报道黄连素可改善三重转基因阿尔茨海默氏病小鼠的空间学习能力和记忆力，还可以减轻Tau的过度磷酸化[9]。黄连素可能通过活化Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路抑制Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡[10]。黄连素可通过lncRNA β-淀粉样蛋白裂解酶1反义RNA(β-amyloid cleaving enzyme 1 antisense RNA，BACE1-AS)/miR-132-3p轴保护神经元细胞免受Aβ25-35的侵害[11]。以上研究结果表明黄连素具有改善AD的作用。本实验用黄连素处理Aβ作用的PC12细胞，结果显示，CyclinD1表达水平显著升高，Cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞OD值显著升高，细胞凋亡率显著降低。说明黄连素可减弱Aβ作用的PC12细胞损伤。

研究报道，肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)也是一种致命的神经退行性疾病，miR-19b-3p在ALS患者中也下调表达[12]。miR-19b-3p过表达减弱了Aβ诱导的SH-SY5Y细胞活力抑制和细胞凋亡促进，是治疗阿尔茨海默氏病的保护剂[13]。本实验结果显示，Aβ诱导的PC12细胞中miR-19b-3p表达水平显著降低，过表达miR-19b-3p可促进Aβ作用的PC12细胞增殖，抑制细胞凋亡。研究报道天然产物抗人通过调控miRNA和自噬延缓阿尔茨海默病的进展[14-19]。本实验结果显示，黄连素处理后Aβ作用的PC12细胞中miR-19b-3p表达水平显著升高。本实验为研究黄连素是否与miR-19b-3p联合起作用，本实验转染miR-19b-3p的过表达载体的同时用黄连素处理，结果显示， 黄连素联合miR-19b-3p也可显著的抑制Aβ作用的PC12细胞凋亡。

综上所述，黄连素联合miR-19b-3p减轻了Aβ诱导的PC12细胞损伤，对阿尔茨海默病模型细胞损伤具有保护作用。