MAPKAPK5-AS1/miR-96对乳腺癌细胞转移的影响及机制

张秀梅 周永华 丛林 刘曙 石明 苏建军

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，发病率与死亡率逐年上升，非编码RNA在基因转录表达过程中发挥重要调控作用，有研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)可通过靶mRNA结合而调控基因表达从而抑制其翻译过程，并可调控细胞增殖、迁移及侵袭等过程[1,2]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)在乳腺癌等肿瘤中异常表达，并可调控肿瘤细胞增殖及迁移[3,4]。因而探讨LncRNA/miRNA在乳腺癌发生及转移过程中的调控机制有助于提高乳腺癌治疗效果及改善患者预后。长链非编码RNA MAPKAPK5-AS1(Long non-coding RNA MAPKAPK5-AS1，LncRNA MAPKAPK5-AS1)在肺癌细胞中表达量升高，并可增强肺癌细胞侵袭能力及抑制细胞凋亡[5]。但MAPKAPK5-AS1在乳腺癌细胞发生及转移过程中的作用机制尚未完全阐明。通过生物信息学分析显示微小RNA-96(microRNA-96，miR-96)可能是MAPKAPK5-AS1的靶基因，研究表明miR-96在乳腺癌、胃癌等肿瘤中异常表达，并可调控细胞增殖、迁移及侵袭等过程[6,7]。但MAPKAPK5-AS1是否可通过调控miR-96的表达从而参与乳腺癌细胞发生及转移过程尚未可知。因此，本研究探讨MAPKAPK5-AS1、miR-96在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞增殖及迁移的影响，探究MAPKAPK5-AS1对miR-96的靶向调控作用，为乳腺癌早期诊断及治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 乳腺癌组织及癌旁组织：选取2017年2月至2018年10月我院收治的乳腺癌患者41例为研究对象，患者均经病理证实为乳腺癌，平均年龄(56.35±8.57)岁，患者均接受手术治疗，于术中切除乳腺癌组织及癌旁组织，放入液氮中保存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情且签署同意书。

1.1.2 试剂：乳腺癌细胞MDA-MB-468购自美国ATCC细胞库；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM减血清培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000与Trizol购自美国Invitrogen公司；反转录与实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；MAPKAPK5-AS1小分子干扰RNA(si-MAPKAPK5-AS1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-96寡核苷酸模拟物(miR-96 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-96特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-96)及阴性对照(anti-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒、增强型化学发光试剂(electrochemiluminescence，ECL)购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗人增殖标记蛋白细胞增殖核抗原67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki67)抗体购自美国CST公司；兔抗人神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:MDA-MB-468细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液接种于96孔板(3×105个/孔)，待细胞生长至80%融合度时将培养基更换为Opti-MEM减血清培养基，参照Lipofectamine 2000说明书进行转染，分别将si-NC、si-MAPKAPK5-AS1、miR-NC、miR-96 mimics、si-MAPKAPK5-AS1与anti-miR-NC、si-MAPKAPK5-AS1与anti-miR-96转染至MDA-MB-468细胞，分别记作si-NC组、si-MAPKAPK5-AS1组、miR-NC组、miR-96组、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC组、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96组，各组转染6 h后将培养基更换为含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，继续培养48 h。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测MAPKAPK5-AS1、miR-96的表达水平:取出冻存乳腺癌组织、癌旁组织及各组转染后的MDA-MB-468细胞，Trizol法提取总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。参照反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。MAPKAPK5-AS1正向引物5’-CGGCACATGGATCTTTCAGG-3’，反向引物5’-TGGCAGAAGGAGTAACAGCA-3’；miR-96正向引物5’-TTTTGCTTGTGTC TCTCCGC-3’，反向引物5’-TCATACGCTACGACTGGCAT-3’；U6正向引物5’-GCTTCGG CAGCACATATACT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40次循环。MAPKAPK5-AS1以GAPDH为内参，miR-96以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算MAPKAPK5-AS1、miR-96相对表达量。

1.2.3 平板克隆形成实验:取对数生长期MDA-MB-468细胞接种于48孔板，按照“1.2.1”分组，每组设置3个复孔，转染48 h后收集细胞，弃旧培养基，PBS洗涤，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为3×104个/ml，按照每孔200个细胞接种于12孔板，继续培养，直至出现肉眼可见细胞克隆的形成，移除培养液，PBS洗涤，0.1%结晶紫染色20 min，清水清洗，风干，置于荧光显微镜下观察细胞克隆形成数。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移:取各组对数生长期MDA-MB-468细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/ml，按照每孔200 μl的密度将细胞悬液加入Transwell小室的上室，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培养液(600 μl)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内继续培养24 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察迁移细胞数。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测MAPKAPK5-AS1的靶基因:starBase预测显示MAPKAPK5-AS1与miR-96存在靶向关系，将含有结合位点及突变位点的序列片段分别插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-MAPKAPK5-AS1、突变型载体MUT-MAPKAPK5-AS1，分别将WT-MAPKAPK5-AS1、MUT-MAPKAPK5-AS1与miR-NC、miR-96 mimics共转染至MDA-MB-468细胞，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养48 h，检测各组荧光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达:取各组对数生长期MDA-MB-468细胞，加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，封闭，孵育一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表达 与癌旁组织比较，乳腺癌组织中MAPKAPK5-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表达

2.2 抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468细胞增殖及迁移的影响 与si-NC组比较，si-MAPKAPK5-AS1组细胞克隆形成数显著减少(P<0.05)，迁移细胞数显著减少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图1，表2。

图1 Western Blot法检测Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

表2 抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468细胞增殖及迁移的影响

2.3 miR-96过表达对MDA-MB-468细胞增殖及迁移的影响 与miR-NC组比较，miR-96组细胞克隆形成数显著减少(P<0.05)，迁移细胞数显著减少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

图2 Western Blot法检测Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

表3 miR-96过表达对MDA-MB-468细胞增殖及迁移的影响

2.4 MAPKAPK5-AS1靶向miR-96 starBase预测显示MAPKAPK5-AS1与miR-96存在靶向结合位点。见图3。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型载体WT-MAPKAPK5-AS1的细胞实验中，与miR-NC组比较，miR-96组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；共转染突变型载体MUT-MAPKAPK5-AS1的细胞实验中，miR-96组荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3，表4。

图3 MAPKAPK5-AS1的序列中含有与miR-96互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 抑制miR-96能减轻抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468细胞增殖的抑制作用 与si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC组比较，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96组细胞克隆形成数显著增多(P<0.05)，Ki67蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图4，表5。

图4 Western Blot法检测Ki67蛋白的表达

表5 抑制miR-96能减轻抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468细胞增殖的抑制作用

2.6 抑制miR-96能减轻抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468细胞迁移的抑制作用 与si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC组比较，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96组迁移细胞数显著增多(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。见表6，图5。

图5 Western Blot法检测N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

表6 抑制miR-96能减轻抑制MAPKAPK5-AS1对MDA-MB-468迁移的抑制作用

3 讨论

LncRNA不具有编码蛋白质的功能，可通过竞争性吸附miRNA而调控其靶基因表达从而调控细胞增殖、迁移及侵袭等生物学过程，既往研究显示LncRNA在乳腺癌中异常表达并可能作为乳腺癌诊断及治疗的潜在靶标[8-10]。但仍有部分LncRNA在乳腺癌发生及转移过程中的作用机制尚未阐明。

MAPKAPK5-AS1在结直肠癌中呈高表达并可通过抑制P21的表达从而促进结直肠癌细胞增殖[11]。沉默MAPKAPK5-AS1表达可显著抑制肺腺癌细胞增殖[12,13]。本研究结果显示MAPKAPK5-AS1在乳腺癌结果显示抑制MAPKAPK5-AS1表达后乳腺癌细胞克隆形成数显著减少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表达可抑制乳腺癌细胞增殖。研究表明Ki67在肿瘤中表达上调，并可促进细胞增殖[14]。本研究结果显示抑制MAPKAPK5-AS1表达后乳腺癌细胞中Ki67表达下调，提示抑制MAPKAPK5-AS1表达可能通过抑制Ki67表达从而减弱乳腺癌细胞增殖能力。本研究结果显示抑制MAPKAPK5-AS1表达后乳腺癌细胞迁移细胞数显著减少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表达可抑制乳腺癌细胞迁移。研究表明上皮-间质转化(EMT)与肿瘤细胞转移能力密切相关，其中E-cadherin属于上皮表型标志物，N-cadherin属于间质型标志物，E-cadherin在肿瘤中表达下调可促使N-cadherin等间质型标志物表达上调从而促进肿瘤细胞迁移及侵袭[15]。本研究结果显示抑制MAPKAPK5-AS1表达后乳腺癌细胞中N-cadherin表达下调，E-cadherin表达上调，提示抑制MAPKAPK5-AS1表达可能通过调控EMT从而抑制乳腺癌细胞迁移。

miR-96在慢性粒细胞白血病中呈低表达，并可靶向BCR-ABL1表达从而抑制慢性粒细胞白血病的发展[16]。研究表明LncRNA TP53TG1通过充当miR-96的海绵分子从而促进胰腺导管腺癌的发展[17]。相关报道指出抑制LncRNA MALAT1表达可通过上调miR-96的表达从而抑制急性髓样白血病细胞增殖[18]。本研究结果显示MAPKAPK5-AS1可靶向调控miR-96的表达及活性，进一步研究显示miR-96过表达可抑制乳腺癌细胞增殖及迁移，并可促进E-cadherin表达及抑制Ki67、N-cadherin表达，提示miR-96过表达可减弱乳腺癌细胞增殖及迁移能力。本研究将si-MAPKAPK5-AS1与anti-miR-96转染至乳腺癌细胞，结果显示细胞增殖能力与迁移能力显著增强，说明抑制miR-96表达可减弱抑制MAPKAPK5-AS1表达对乳腺癌细胞增殖及迁移的作用。提示抑制MAPKAPK5-AS1表达可能通过上调miR-96表达从而减弱乳腺癌细胞增殖及迁移。

综上所述，乳腺癌组织中MAPKAPK5-AS1表达量升高，抑制MAPKAPK5-AS1表达可抑制乳腺癌细胞增殖及迁移，其作用机制可能是通过靶向调控miR-96的表达而发挥作用，可为乳腺癌的诊断及治疗提供潜在靶点。