miR-96-5p调控FOXO4表达影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡

张岚 田荣

瘢痕疙瘩是皮肤组织受损后异常愈合的一种皮肤瘤，主要原因在于皮肤成纤维细胞异常增殖导致细胞胶原分泌量增加进而促使结缔组织增生或变形最终形成瘢痕[1,2]。瘢痕疙瘩的形成已严重影响患者身心健康，目前临床主要采用手术、药物、激光等技术进行治疗，但治疗效果不佳，患者复发率高。研究表明促进成纤维细胞凋亡及抑制细胞增殖可有效改善瘢痕疙瘩[3]。因而基于瘢痕疙瘩形成的分子机制拟寻找治疗靶点从而提高治疗效果及降低复发率。微小RNA(microRNA，miRNA)可通过调控基因表达从而参与细胞增殖、凋亡等多种生物学过程，研究表明部分miRNA在瘢痕疙瘩中异常表达，并可调控多种基因表达，但关于其具体作用机制尚未阐明[4]。微小RNA-96-5p(microRNA-96-5p，miR-96-5p)可抑制肝细胞癌细胞凋亡，促进肿瘤发展进程[5]。研究表明miR-96-5p在宫颈癌中上调表达，抑制miR-96-5p表达可抑制宫颈癌进展[6]。但miR-96-5p在瘢痕疙瘩形成过程中的调控机制尚未可知。Starbase预测显示叉头样转录因子O4(forkhead box O4，FOXO4)可能是miR-96-5p的靶基因，研究表明FOXO4在非小细胞肺癌中呈低表达，并可促进肿瘤细胞转移[7]。目前miR-96-5p是否可通过调控FOXO4的表达参与瘢痕疙瘩形成过程尚未可知。本研究主要探讨miR-96-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响，分析其对FOXO4的调控作用，旨在为瘢痕疙瘩的诊断及治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 瘢痕组织与正常皮肤组织来源：收集2017年6月至2018年3月我院外科需手术切除的瘢痕组织离体标本(30例)，收集患者临床病理资料，主要包括性别、年龄、皮损部位等，男16例，女14例；年龄20～35岁，平均年龄(25.54±5.46)岁。纳入标准：患者均符合临床诊断标准；向周围侵袭性生长超出原损伤范围；外科手术切除后复发；皮损部位无感染病灶。正常皮肤组织离体标本15例，其中男8例，女7例；年龄18～46岁，平均年龄(28.54±5.49)岁；患者接受皮肤外科手术中修整“猫耳”切除的正常皮肤组织作为正常组。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情且签署同意书。

1.1.2 试剂与仪器：杜氏改良培养基(DMEM)购自美国Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher公司；miR-96-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-96-5p)及阴性对照(anti-miR-NC)、miR-96-5p模拟物(mimics)、阴性对照(miR-NC)、FOXO4小干扰RNA(si-FOXO4)、乱序无意义阴性对照(si-NC)购自广州锐博生物科技有限公司； pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒与SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自上海生工生物工程股份有限公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒、增强型化学发光试剂(electrochemiluminescence，ECL)购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗人细胞周期蛋白1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-caspase-3)抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗人FOXO4抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞的原代培养:取出瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织，除去表皮及皮下脂肪，无菌盐水冲洗，剪切成1 cm×1 cm×1 cm的组织块，接种至无菌培养瓶，加入2 ml含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养，每2天更换一次培养液，待组织块周围长满细胞时将其转移至另一新的无菌培养瓶。取出培养瓶，弃旧培养液，PBS冲洗，加入1 ml含有10%胎牛血清的DMEM培养基，3～5 min后置于显微镜下观察细胞状态，加入2 ml含有10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，吹打混匀，4℃条件下经1 000 r/min转速离心5 min，取上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，按照1∶2比例进行传代培养。

1.2.2 细胞转染与实验分组:取对数期瘢痕疙瘩成纤维细胞，按照每孔3×105个/ml的密度接种于6孔板，待细胞融合度为30%时进行转染，按照Lipofectamine 2000说明书分别将anti-miR-96-5p(anti-miR-96-5p组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、pcDNA-FOXO4(pcDNA-FOXO4组)、pcDNA-NC(pcDNA-NC组)、anti-miR-96-5p与si-NC(anti-miR-96-5p+si-NC组)、anti-miR-96-5p与si-FOXO4(anti-miR-96-5p+si-FOXO4组)转染至细胞，转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基，继续培养48 h收集细胞。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-96-5p、FOXO4 mRNA的表达水平:采用Trizol法提取各组细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度，根据反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。miR-96-5p正向引物5’-GCGCTCTTCTTTGCCTGTTT-3’，反向引物5’-AGCATGTCTGTCTTGTCCCA-3’；U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；FOXO4 正向引物5’-TCCTCACTCCTACCATCCCA-3’，反向引物5’-GTCAAGAGAGCCTCCAGTGT-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。miR-96-5p以U6为内参，FOXO4以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-96-5p、FOXO4 mRNA相对表达量。

1.2.4 MTT检测细胞增殖:收集各组转染的瘢痕疙瘩成纤维细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，按照每孔100 μl的密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，各组继续培养48 h时每孔加入MTT溶液20 μl(质量浓度5 mg/ml)，37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养4 h，室温条件下经1 300 r/min转速离心5 min(离心半径8 cm)，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值，计算细胞存活率。实验设置3次重复。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡:收集各组对数期瘢痕疙瘩成纤维细胞，0.25%胰蛋白酶消化，4℃条件下经1 000 r/min转速离心6 min(离心半径6 cm)，弃上清，预冷PBS洗涤，加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，室温孵育10 min，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测miR-96-5p的靶基因:starbase预测FOXO4与miR-96-5p存在结合位点，将结合位点插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-FOXO4，利用基因突变技术将结合位点进行突变，将突变位点插入荧光素酶报告基因载体构建突变型载体MUT-FOXO4，取生长状态良好的瘢痕疙瘩成纤维细胞，分别将WT-FOXO4、MUT-FOXO4与miR-NC、miR-96-5p mimics共转染至细胞，转染48 h后收集细胞，检测相对荧光素酶活性。后续实验中采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测miR-96-5p过表达或抑制miR-96-5p表达对FOXO4表达水平的影响，实验分组：miR-NC组、miR-96-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-96-5p组。

1.2.7 Western Blot检测FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表达:收集各组瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，封闭，室温条件下孵育一抗(FOXO4 1∶800、CyclinD1 1∶1 000、C-caspase-3 1∶1 000)稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗涤，孵育二抗(1∶2 000)稀释液，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加ECL，曝光，显影，应用凝胶成像分析系统及ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-96-5p、FOXO4的表达情况 与正常组比较，瘢痕组瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-96-5p的表达水平显著升高(P<0.05)，FOXO4 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表1，图1。

表1 瘢痕疙瘩成纤维细胞中 miR-96-5p和FOXO4表达量

图1 Western Blot检测FOXO4

2.2 低表达miR-96-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响 qRT-PCR检测结果显示，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-96-5p组瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-96-5p的表达水平显著降低(P<0.05)。提示成功降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-96-5p的表达。相对于anti-miR-NC组，anti-miR-96-5p组瘢痕疙瘩成纤维细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表2，图2。

表2 低表达miR-96-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

图2 低表达miR-96-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响；A 流式细胞仪检测细胞凋亡;B Western Blot检测CyclinD1、C-caspase-3蛋白的表达

2.3 高表达FOXO4对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响 Western Blot检测结果显示，pcDNA-FOXO4组瘢痕疙瘩成纤维细胞中FOXO4蛋白相对表达量显著高于pcDNA-NC组(P<0.05)。与pcDNA-NC组相比，pcDNA-FOXO4组瘢痕疙瘩成纤维细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见图3，表3。

图3 Western Blot检测FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白的表达

表3 高表达FOXO4对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

2.4 miR-96-5p靶向FOXO4 starbase预测显示FOXO4与miR-96-5p存在结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型报告基因载体WT-FOXO4的细胞实验中，miR-96-5p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.05)；转染突变型报告基因载体MUT-FOXO4的细胞实验中，miR-96-5p组荧光素酶活性相较于miR-NC组差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-96-5p组瘢痕疙瘩成纤维细胞中FOXO4蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-96-5p组瘢痕疙瘩成纤维细胞中FOXO4蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表4、5，图4。

图4 miR-96-5p靶向FOXO4；A starbase对FOXO4和 miR-96-5p结合进行预测示意图；B Western Blot检测FOXO4蛋白的表达

表4 miR-NC或miR-96-5p与FOXO4野生型及突变型报告质粒共转染瘢痕疙瘩成纤维细胞瘢痕疙瘩成纤维细胞后双荧光素酶活性检测

2.5 低表达FOXO4可以部分逆转miR-96-5p低表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响 实验结果显示，与anti-miR-96-5p+si-NC组相比，anti-miR-96-5p+si-FOXO4组瘢痕疙瘩成纤维细胞中FOXO4蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见图5，表6。

表5 Western Blot检测FOXO4 蛋白的表达

图5 Western Blot检测FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表达

表6 低表达FOXO4可以部分逆转miR-96-5p低表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

瘢痕形成与成纤维细胞异常增殖、胶原蛋白异常沉积密切相关，研究表明成纤维细胞增殖、凋亡等可能与抑癌基因失活及癌基因激活有关[8,9]。既往研究显示miRNA在瘢痕形成过程过程发挥重要调控作用，但关于其调控机制尚未阐明[10]。因此本研究探寻新型miRNA并分析其在瘢痕形成过程中的作用机制，为揭示瘢痕疙瘩形成的分子机制奠定理论基础。

miR-96-5p在结直肠癌细胞中呈高表达，其高表达量与患者预后不良密切相关[11]。研究表明miR-96-5p通过靶向FOXO3促进胃癌细胞的增殖[12]。相关报道指出miR-96-5p通过抑制Caveolae1促进卵巢癌细胞的增殖和迁移[13]。本研究结果显示瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-96-5p的表达水平显著升高，提示miR-96-5p表达量升高可能促进瘢痕疙瘩形成。本研究进一步检测结果显示抑制miR-96-5p的表达后瘢痕疙瘩成纤维细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示抑制miR-96-5p的表达可通过抑制成纤维细胞增殖及促进细胞凋亡从而抑制瘢痕疙瘩形成。研究表明CyclinD1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白，增生瘢痕中CyclinD1的表达量升高并可通过与细胞周期依赖蛋白激酶(CDK4/6)结合形成复合物从而促进细胞周期进展，促进细胞增殖[14]。相关报道指出caspase-3是caspase家族主要成员，其可破坏细胞结构而阻断细胞DNA复制及修复进而促使细胞凋亡[15]。本研究结果显示抑制miR-96-5p的表达后瘢痕疙瘩成纤维细胞中CyclinD1表达下调，C-caspase-3表达上调，提示抑制miR-96-5p的表达可能通过促进C-caspase-3表达及抑制CyclinD1表达从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，诱导细胞凋亡。

FOXO4低表达量与膀胱癌患者不良预后密切相关[16]。研究表明FOXO4表达量降低可参与肝癌的发生[17]。miR-150通过靶向FOXO4促进宫颈癌细胞的生长[18]。本研究结果显示FOXO4在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达水平明显降低，进一步研究显示上调FOXO4的表达后瘢痕疙瘩成纤维细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，CyclinD1蛋白表达水平显著降低，C-caspase-3蛋白表达水平显著升高，提示FOXO4过表达可能通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达从而促进成纤维细胞凋亡及抑制细胞增殖。本研究显示，miR-96-5p可靶向结合FOXO4并负向调控FOXO4的表达，抑制FOXO4的表达联合抑制miR-96-5p表达处理成纤维细胞，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，CyclinD1蛋白表达水平明显升高，C-caspase-3蛋白表达水平显著降低，说明抑制FOXO4表达可部分逆转抑制miR-96-5p表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响。提示抑制miR-96-5p表达可通过上调FOXO4表达从而影响瘢痕疙瘩成纤维细

胞增殖及凋亡。

综上所述，miR-96-5p可能通过下调FOXO4的表达从而促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并抑制细胞凋亡，为揭示瘢痕疙瘩形成机制奠定理论基础，为以miR-96-5p为靶点的瘢痕疙瘩的防治提供理论依据。但关于miR-96-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中介导的相关信号通路尚需进一步研究。