慢病毒介导的干扰及过表达HSP90β对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭的影响*

刘辉琦，杰永生，郑 蕊，綦 惠，陈 磊，靳少锋，舒 雄△

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院，北京 100035)

研究显示，HSP90家族与肿瘤关系密切。该家族主要有HSP90α、HSP90β两种同分异构体，尽管二者同源性为84%，但生物学特性仍有所差别。目前认为，HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，参与肿瘤细胞的增殖，而HSP90β与肿瘤细胞分化相关。因此，尽管两种异构体在多种肿瘤中表达增加，但在不同肿瘤中的表达强度有所差异。研究提示HSP90β在胃癌、结肠癌、骨肉瘤等多种肿瘤中表达明显增强[1，2]，与肿瘤侵袭、耐药等相关[3，4]，进而影响肿瘤的发展及预后。为明确HSP90β与骨肉瘤侵袭的关系，本研究通过慢病毒介导的干扰及过表达探讨HSP90β对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭的影响。

1.材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤细胞系MG-63(美国ATCC公司)；EMEM液体培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-One qPCR Mix(美国GeneCopoeia公司)；感染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；RNAzol®RT(美国Molecular Research Center公司)；小鼠抗人HSP90β单克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体(美国Abcam公司)；兔抗人MMP2单克隆抗体、兔抗人Snail单克隆抗体、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(美国CST公司)；PierceTMBCA Protein Assay Kit(美国Thermo公司)。其他相关生化试剂为进口分装或国产分析纯产品。

引物合成及测序由美国GeneCopoeia公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HSP90β的扩增和干扰靶点设计及引物合成

提取MG-63基因组DNA，合成正向引物F-HSP90β(5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′)、反向引物R-HSP90β(5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′)，以基因组DNA为模板扩增合成目的基因h-HSP90β的CDS区域。根据shRNA设计原则，按照人HSP90β基因的mRNA序列(GeneBank Accession No.NM_003299.1)设计shRNA靶序列和对照病毒载体序列(靶病毒序列：F 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；R 5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′。对照病毒序列：F 5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′；R 5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′)。

1.2.2 HSP90β干扰和过表达慢病毒载体构建

使用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性内切酶对目的基因及慢病毒过表达载体进行酶切，并与pEZ-Lv201-eGFP-puro载体链接构建HSP90β-pEZ过表达质粒。将psi-LVRU6GP-eGFP-puro慢病毒干扰载体与shRNA模板链接构建HSP90β-shRNA干扰质粒。利用DH5α大肠杆菌进行转化，获取阳性克隆并扩增，通过聚合酶链反应及测序进行鉴定及分析。

1.2.3 重组表达HSP90β慢病毒脂质体的包装

利用Lipofectamine 2000包装pSPAX2和pMD2G质粒，制备完成的重组慢病毒质粒LVRU6GP-shRNA-HSP90β、HSP90β-pEZ转入H1299细胞。转染6 h后弃含有感染混合物的培养基，更换含10% FBS的新鲜完全培养基，置培养箱(37℃，5% CO2)培养48 h，收集细胞上清。补充完全新鲜培养基后继续培养72 h，收集所有细胞上清，离心(4℃，2000r/min，10min)去除细胞碎片后再离心(4℃、20000 r/min，120 min)，所获病毒原液分装冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.4 嘌呤霉素最小致死浓度(minimum lethal concentration，MLC)测定

用培养基将嘌呤霉素配制为梯度浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0μg/mL)筛选培养基。按4×104(20%～35%)个/孔细胞数筛选培养基接种于24孔板，每个梯度设两个复孔，另有两孔做不加药对照。置培养箱(37℃，5% CO2)培养，两天后换液，换液筛选浓度保持不变，以3天内杀死所有细胞的最小嘌呤霉素浓度为最小致死浓度。

1.2.5 感染复数(multiply of infection，MOI)测定

用胰蛋白酶消化计数对数增殖期细胞，按5×103个细胞/孔接种于96孔板中的15个孔，过夜培养(37℃，5% CO2)，达50%～60%的细胞汇合密度。病毒液以冰水浴融化，瞬时离心。将培养液(5%FBS完全培养基含双抗)按5个MOI设定值(1、10、50、100、200)稀释病毒原液。弃去96孔板中的培养基，加入不同设定值慢病毒稀释液(100μL/孔)，每个稀释度设3个复孔，培养(37℃，5% CO2，72h)。检测各孔荧光细胞百分比。

1.2.6 MG-63细胞慢病毒感染

在24孔板上按2.5×105个/孔接种MG-63细胞，待细胞汇合度达50%～60%时，根据病毒感染复数和细胞量加入相应体积的病毒原液置培养箱(37℃，5% CO2)培养24 h，更换无病毒的适应性培养基，继续培养(37℃，5% CO2)24 h ，除去未感染病毒的细胞，用嘌呤霉素适应性培养基(1μg/mL)培养(37℃，5% CO2)1周，杀死所有未感染病毒的细胞，使慢病毒感染细胞稳定传代。

1.2.7 mRNA相对表达量检测

使用实时荧光定量PCR法检测。用RNAzol®RT提取总RNA。用All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录：37 ℃下预反应60 min；85 ℃下扩增5 min。引物序列F：GCGAGTCAGAGAAAACATTTG；R：AAAAGATACCCTGACCGAAGC。参照All-in-One qPCR Mix说明书进行qRT-PCR反应，反应条件：95 ℃下预变性10 min；95 ℃下变性10 s，60 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸15 s，共40个循环。

1.2.8 HSP90β对MG-63细胞侵袭的检测

用胰蛋白酶消化、收获对数增殖期的HSP90β-shRNA MG-63细胞和HSP90β-pEZ MG-63细胞。用Matrigel包被Transwell上室并以2×104个/孔接种细胞，下室加入含血清的完全培养基0.6 mL。置培养箱培养(37℃，5% CO2，24h)，取下底膜，行DAPI染色，封片，置荧光显微镜下计数穿膜细胞。

1.2.9 HSP90β及侵袭相关蛋白的表达检测

1.2.10 统计学分析

2.结果

2.1 过表达慢病毒载体HSP90β-pEZ鉴定

琼脂糖凝胶电泳显示载体被切割成线性、插入片段碱基正确(图1A-C)。测序显示插入碱基序列与构建的目的基因片段完全一致。

A：DNA Marker；B：HSP90β-pEZ plasmid；C：HSP90β-pEZ plasmid digested by BsrG and SalⅠ

2.2 干扰慢病毒载体HSP90β-shRNA鉴定

琼脂糖凝胶电泳显示载体被切割成线性、插入片段碱基正确(图2A-C)。测序峰图(图2D)显示干扰序列正确。

A：DNA Marker；B：HSP90β- shRNA plasmid；C：HSP90β-shRNA plasmid digested by AflI I and Sal I；D：HSP90β-shRNA gene sequence

2.3 嘌呤霉素最小致死浓度测定

结果显示，慢病毒感染的MG-63的嘌呤毒素最小致死浓度为3μg/mL(图3)。

图3 慢病毒感染MG-63的嘌呤霉素最小致死浓度筛选图(μg/mL)

2.4 慢病毒感染MG-63细胞MOI测定

结果显示，感染复数为200时，80%的MG-63细胞被感染(图4)。

图4 慢病毒感染MG-63细胞感染复数筛选图

2.5 MG-63细胞的HSP90β干扰和过表达慢病毒载体感染

感染复数为200时，80%的MG-63细胞被感染，最小嘌呤毒素致死浓度为3 μg/mL。结果显示，干扰HSP90β-shRNA组荧光表达弱于干扰阴性对照组(NEG-shRNA)，过表达HSP90β-pEZ组荧光表达强于过表达对照组(NEG-pEZ)(图5)。

图5 慢病毒感染MG-63荧光鉴定图

2.6 HSP90β干扰和过表达mRNA 和蛋白检测

mRNA检测显示，HSP90β-shRNA组明显低于NEG-shRNA组(P<0.01)，干扰效率为81.15%；HSP90β-pEZ组显著高于NEG-pEZ组(P<0.01)(图6)。蛋白检测显示，HSP90β-shRNA组明显低于NEG-shRNA组，HSP90β-pEZ组明显高于NEG-pEZ组(图7)，各组HSP90β蛋白与mRNA相对表达水平一致。

**P<0.01

2.7 干扰及过表达HSP90β对MG-63侵袭的影响

Transwell小室检测显示，过表达HSP90β-pEZ细胞侵袭数是HSP90β-shRNA细胞的1.6倍(274±23 vs 173±16)(P<0.01)(图8～9)。

A.HSP90β-shRNA MG-63细胞 B.MG-63细胞 C.HSP90β-pEZ MG-63细胞

**P<0.01 *P<0.05

2.8 干扰及过表达HSP90β对骨肉瘤细胞侵袭相关蛋白表达的影响

用Western-blot法检测干扰及过表达HSP90β对骨肉瘤细胞侵袭相关蛋白表达的影响。结果显示干扰HSP90β表达的MG-63骨肉瘤细胞中，E-cadherin表达上调，MMP2、Snail表达下调，细胞侵袭减弱，而过表达HSP90β的骨肉瘤细胞，E-cadherin表达下调，MMP2、Snail表达上调，细胞侵袭性增强(图10)。

**P<0.01

3.讨论

骨肉瘤是骨骼系统中最常见的恶性肿瘤，多发于青少年，具有恶性度高、早期转移的特点[5，6]。目前新辅助化疗联合保肢手术是骨肉瘤的主要治疗方案，但发生转移后5年生存率显著降低，因此远处转移及复发是影响骨肉瘤疗效与预后的重要因素[7]。热休克蛋白在所有真核细胞表达，是一类细胞含量丰富、高度保守的分子伴侣，能够防止或降低各种刺激对细胞引起的损伤，提高细胞生存率。在肿瘤发生发展中，癌细胞为了在恶劣环境中稳定肿瘤相关蛋白并促进自身的存活与增殖，往往会促进HSP的表达，因而大多数肿瘤中的HSP表达都出现不同程度的上调。HSP90是热休克蛋白家族重要成员，在多种肿瘤中表达增高，以多种方式影响肿瘤生物学行为：①产生促自身生长信号；②逃避细胞凋亡；③降低对生长抑制信号的敏感性；④促进血管生成；⑤获得无限增殖能力；⑥促进侵袭和转移[8，9]。前期研究显示，HSP90的两个同分异构体HSP90α、HSP90β在骨肉瘤中表达均增高，但HSP90β的阳性率高于HSP90α(77.78% vs 57.78%)，且表达强度也高于后者[3]。

为进一步研究HSP90β在骨肉瘤中的作用，本研究利用慢病毒载体构建了干扰及过表达HSP90β的骨肉瘤MG-63细胞。借助于慢病毒构建的慢病毒载体是高效的体外外源性基因传递工具，通过感染细胞，将目的基因整合到宿主细胞基因组并稳定表达，以此对目的基因进行研究[10，11]。由于慢病毒具有感染效率高、免疫原性低的特点，使得慢病毒载体相关实验得到了广泛的应用[12]。本研究成功构建了HSP90β干扰/过表达慢病毒载体，干扰序列正确，无突变，并可稳定转染人骨肉瘤MG-63细胞。转染HSP90β干扰/过表达慢病毒载体，人骨肉瘤MG-63细胞侵袭能力出现下降/增强，提示特异性抑制或者促进HSP90β的表达可以抑制或促进骨肉瘤的侵袭，表明HSP90β的表达与MG-63细胞的侵袭相关。

肿瘤的侵袭和转移是一个极其复杂的包括多个相对独立步骤的非连续性动态过程，受肿瘤细胞本身的分子表型、生物学特性和宿主微环境等多种因素的影响。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是钙黏蛋白家族成员之一，生理条件下通过增加细胞间黏附力，抑制细胞增殖活动，维持组织器官正常形态，但在肿瘤发生过程中，E-cadherin表达下降，细胞间黏附作用减弱，促进了肿瘤细胞的侵袭及转移[13，14]。基质金属蛋白酶家族重要成员MMP2具有分解基底膜和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)明胶酶的作用，进而造成局部溶解，为肿瘤的转移创造了条件[15，16]。Snail是一类锌指转录因子，具有转录抑制因子的生理功能，在肿瘤发生发展中可直接抑制E-cadherin的表达，促进肿瘤细胞的侵袭、转移[17，18]。本研究结果提示HSP90β可以调节E-cadherin、MMP2及Snail的表达，骨肉瘤MG-63细胞高表达HSP90β，通过下调E-cadherin、上调MMP2及Snail的表达参与了骨肉瘤的早期转移。