环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究※

谢 辉，祁芝珍，杨晓艳，赵海红，刘中凯，李 胜，张 琪

(青海省地方病预防控制所，青海 西宁 811602)

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型恒温核酸扩增技术，能否应用于鼠疫现场观点不一，本研究拟考察环介导等温扩增技术(LAMP)检测鼠疫实验感染动物的敏感性及检测时间，探讨在鼠疫流行现场应用LAMP技术的可行性。现将有关研究情况报告如下。

1.材料与方法

1.1 材料

试剂及仪器：LAMP引物由北京擎科生物有限公司合成，Loopamp®朗報®DNA扩增试剂盒(批号98004)、Loopamp荧光目视检测试剂盒(批号98002)由北京成志科为生物科技有限公司提供；鼠疫胶体金免疫层析试纸(批号202001)由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供；中国细菌浊度标准吧管(批号2018-1)由中国药品生物制品检定所提供；恒温水浴箱ZC-22Q由杭州卓驰仪器有限公司提供。

实验动物：小白鼠、 豚鼠、大耳白兔由重庆鹏鑫生物科技有限公司西安分公司提供。

培养基：赫氏培养基由青海省地方病预防控制所培养基室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物感染

1.2.2 鼠疫耶尔森菌反向血凝试验(RIHA)：

分别取制备的脏器悬液，按照鼠疫诊断标准(WS279-2008)[1]方法进行反向血凝试验。

1.2.3 细菌检测

按照鼠疫诊断标准(WS279-2008)方法进行细菌学检测。

1.2.4 鼠疫胶体金免疫层析法(RGICA)试验

按1.2.1方法制备脏器悬液取上清液200 μL加入胶体金免疫层析试纸条检测孔内，15 min后观察结果：见两条显色带视为阳性结果，仅见一条显色带视为阴性结果。同时做空白对照。

1.2.5 模板制备

采用煮沸法，取动物脏器悬液于100 ℃水浴加热10 min，离心(12000r/min)取上清液作为DNA模板。将模板置-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增技术(LAMP)试验

引物合成根据NCBI数据库(GenBank登录号AF350075)公布的鼠疫耶尔森菌3a基因序列，用Priner Explorer version 4在线软件设计LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP以及相应的环引物(表1)。模板制备方法同1.2.5所示方法。

表1 引物序列

LAMP反应体系及反应条件：反应体系(25μL)包括：2×Reaction Mix.(12.5μL)、混合引物(1μL。引物浓度：F3、B3为5pmol/μL，BIP、FIP为40pmol/μL)、Bst DNA聚合酶(1μL)、DNA模板(2μL)、荧光染料(1μL)、灭菌纯水(补至25μL)；使用恒温水浴加热(65℃)1 h。

2.结果

2.1 检测结果

LAMP检出率为100%，检测时间为1 h，细菌学培养检出率为100%，检测时间最短需24 h，RIHA检出率低于细菌学检验，检测时间为2 h，RGICA检出率最低，检测时间为15 min(表2)。

表2 各类动物材料检测结果

2.2 敏感性结果

表3 LAMP与RIHA法检测动物材料的敏感性试验结果

1～12是不同稀释度(40～81920)的LAMP可视化结果；13是阳性对照结果；14～15是阴性对照结果

3.讨论

为考察LAMP检测鼠疫实验感染动物的敏感性及检测时间，探讨在鼠疫流行现场应用LAMP技术的可行性，我们在研究鼠疫菌的敏感性和特异性基础上[2-3]，对本研究目的进行了一系列的实验探索。RIHA试验是目前应用广泛的鼠疫诊断方法之一，资料表明该方法最低检菌量是2.5～5万个菌/mL[4]，RGICA 是6万个菌/mL[5]，当菌量低于2.5万个菌/mL时RIHA、RGICA检不出阳性结果，LAMP的最低检菌量是20个菌/mL[2]，实验结果显示，LAMP法检测各种动物脏器的阳性符合率为100%，LAMP 检出率优于RIHA、RGICA。本试验阳性结果呈绿色，阴性对照结果为桔红色，肉眼观察结果清晰，易判断。

从检测时间来看，细菌学培养在材料新鲜情况下可做检测且检测时间最短(24h)，而腐败材料或患者用过抗生素，则不能对突发的鼠疫疫情做出快速判定；RIHA试验受反应温度等条件制约，结果判定依赖检验人员专业层次及累积经验因素的限制，最快的结果需2 h；RGICA检测时间最短(15min)，其方法是采用鼠疫单克隆抗体作为探针，捕捉特异性的FI抗原[6]，具有较强的特异性，但敏感性不高，易漏诊[7]；LAMP法的特点在于不需要特殊仪器设备，在1 h内即可观察结果，结果直观可靠，适合在野外疫区快速诊断。

本研究结果显示，LAMP技术具有高度敏感性，1 h内肉眼可判读结果，在鼠疫流行现场应用LAMP技术具有可行性。