VEGF在高成瘤MDCK、Hela细胞裸鼠模型肿瘤中的表达情况

许 瑾，张 兰，钟璧欢，黄 婕，杨映雪，乔自林,2,3，杨 琨,2*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；

2.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），是一种高度特异性促进血管内皮细胞生长的因子，可以有效促进肿瘤细胞的生长以及肿瘤血管的生成[1]。科学研究表明，肿瘤血管比正常血管对VEGF敏感[2]。VEGF与血管内皮细胞表面受体结合后通过自分泌及旁分泌调节机制，促进血管内皮细胞分裂增殖，血管内皮通透性增加，使血浆蛋白渗出，为肿瘤生长提供合适的微环境。也有相关研究显示[3-4]，VEGF在低氧或缺氧条件下，有利于其与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表面受体结合，促进VEGF-A的分泌，进而促进肿瘤血管形成、侵袭及转移。此外，肿瘤的恶性程度以及不同分化程度也会影响VEGF的作用水平[5]。

MDCK细胞是Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离出的呈贴壁生长的上皮样细胞。MDCK细胞增殖迅速、易培养，对流感病毒敏感且不易发生突变[6]。Hela细胞系是一种常用于肿瘤研究的细胞系，采用人工体外培养方式可以无限繁殖。试验选取裸鼠为研究对象，裸鼠先天性胸腺依赖性免疫功能缺乏或T、B淋巴细胞功能完全丧失，异种移植不产生排斥反应，并且皮下注射肿瘤细胞系的基因将导致裸鼠成瘤[7]。本次试验通过HE染色法观察肿瘤形态学特征；免疫组织SP法化学染色检测血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤中的分布情况，为探究肿瘤形成机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

免疫功能缺陷小鼠：每组1 0只，雌性BALB/c裸小鼠4～7周大，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试剂与仪器

试验材料：Hela细胞悬液，购自国家实验细胞资源共享服务平台；MDCK细胞，购自ATCC细胞库；VEGF多克隆抗体和免疫组织化学检测试剂盒（SP-0023），均购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB浓缩型显色试剂盒（DA1010），购自北京索莱宝科技有限公司。

试验仪器：病理组织切片机和YD-AB2生物组织摊-烤片机，均购自金华市益迪医疗设备有限公司；电热鼓风干燥箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司；显微镜拍照系统等。

1.3 方法

1.3.1样本采集 前期通过注射等量的不同细胞悬液构建裸鼠模型。

高成瘤MDCK细胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl前期项目组经单细胞克隆实验，克隆出具有高度成瘤性的MDCK细胞悬液。

Hela细胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl Hela细胞悬液。

饲养4个月后，颈椎脱臼法处死后采集其肿瘤等新鲜组织立即置于4%多聚甲醛中固定，长期室温保存，每隔12小时更换1次固定液。

1.3.2组织包埋 采集组织于4%多聚甲醛中固定1～2个月后，将肿瘤切至体积约1 cm3进行石蜡包埋。包埋好的组织蜡块低温储存。病理组织切片机切片，先进行厚度为20 μm的粗切，待观察组织完全暴露转为厚度为5 μm的细切。取细切的组织于组织摊-烤片机中，摊片（温度45 ℃），后烤片（温度45 ℃），待组织周围石蜡与载玻片紧密粘附无水滴（约2 h）即可收片于切片盒中储存。

1.3.3 HE染色 首先选取组织切片进行烤片45 ℃（15 min），其次依次进行脱蜡至水—苏木精核染（约2 min）—流水冲洗（10 min）—酸水分化（约2～3 s）—流水冲洗（10 min）—伊红染色（约4 min）—酒精分化—脱水—透明等一系列步骤，最后使用中性树脂封片，并观察。

1.3.4免疫组织SP法化学染色 组织切片经15 min4 5 ℃烤片，再依次进行脱蜡至水、抗原修复（柠檬酸盐缓冲液-微波热修复法）、阻断、滴加A液（封闭用正常山羊血清工作液）、滴加一抗、二抗、湿盒37 ℃孵育、滴加三抗（辣根酶标记链霉卵白素工作液）、孵育、DAB显色、苏木精复染等一系列操作，最后用中性树脂封片。其中，阻断液、A液、二抗、三抗工作液均来自免疫组化SP试剂盒；一抗为兔的多克隆抗体。

2 结果与分析

2.1 肿瘤的形态学观察

Hela细胞、高成瘤MDCK细胞裸鼠模型中，两种异源移植瘤的结构相同。选取Hela裸鼠模型中的肿瘤组织进行分析。HE染色后对肿瘤组织学结构观察，染色结果如图1所示。图1A观察到：裸鼠皮下注射部位形成的肿瘤呈现结节状，肿瘤边缘处细胞分布密集，成巢状，细胞体积较大，胞核大小不一。异源移植瘤中心位置可见坏死情况，大多为崩解碎裂的肿瘤细胞。图1B观察到，异源移植细胞形成的肿瘤周围组织中有较为丰富的血管分布。

图1 肿瘤HE染色结果观察

2.2 VEGF在肿瘤中的表达及分布情况

如图2所示，在异源移植细胞形成的肿瘤中，VEGF在肿瘤生长的周围组织中阳性表达显著，肿瘤边缘细胞次之，肿瘤中心位置的细胞阳性表达最弱。VEGF在肿瘤生长周围组织以及细胞胞质中表达，细胞核中不表达。注射高成瘤MDCK细胞形成的肿瘤中有淋巴滤泡样结构的肿瘤细胞灶（如图2D）；通过图2C、图2D对比可知，VEGF在肿瘤生长的周围组织中含量：图2C＞图2D，肿瘤中心部位VEGF在图2C上呈现强而少的分布，图2D上表达呈现弱而广的分布。VEGF分别在Hela细胞、高成瘤MDCK细胞裸鼠模型肿瘤中都存在表达，表达位置相同，但每个结构表达的含量存在差异。

图2 VEGF蛋白免疫组化染色结果

3 讨论

VEGF具有促进血管生成，增强血管细胞壁通透性的功能[8]，肿瘤微环境中VEGF含量的增加有利于肿瘤血管的形成。肿瘤形成后，由于肿瘤细胞周围没有新血管，氧气以及营养物质供给不足，此时肿瘤细胞需要通过扩散的方式获取营养，因而生长缓慢。当周围新血管生成后，肿瘤生长所需要的营养物质由血管供给，肿瘤细胞迅速生长繁殖[2]。肿瘤周围组织以及肿瘤边缘细胞处VEGF含量的增多，促进肿瘤血管生成，这也就说明了本次试验中发现VEGF在肿瘤周围近皮肤侧的组织以及肿瘤边缘均呈现阳性表达的原因。同时，在近皮肤侧的组织有血管分布，可能是肿瘤形成并已经进入迅速生长状态的重要标志，阻断肿瘤血管的生成可能是抑制肿瘤生长的途径之一。研究发现，大部分肿瘤细胞也可以分泌VEGF，加快血管内皮细胞增殖速度，为肿瘤细胞的生长提供物质基础，促进肿瘤进一步形成[9-10]。肿瘤的形成速率以及分化程度都会影响微环境中VEGF的水平[5]，试验中也发现，高成瘤MDCK细胞裸鼠模型的肿瘤组织中有淋巴滤泡样结构的肿瘤细胞灶形成，肿瘤内部VEGF的分布广而弱；Hela细胞裸鼠模型中肿瘤内部的VEGF呈现强而少的分布状态。VEGF在皮下注射Hela细胞形成的肿瘤近皮肤侧的组织含量较高，且血管分布较多，说明皮下注射Hela细胞形成的肿瘤可能主要通过促进微环境中的VEGF以及内部肿瘤细胞分泌的VEGF含量增多来共同促进血管的生成，有利于肿瘤的生长。而注射高成瘤MDCK细胞形成的肿瘤则是通过肿瘤内部细胞分泌的VEGF含量增多以促进血管形成，同时更易形成肿瘤细胞灶，促进肿瘤细胞发生迁移。由此推测出，注射高成瘤MDCK细胞与注射Hela细胞可能具有同等强度的成瘤性，形成肿瘤的恶性程度可能相同，但肿瘤的形成机制可能不同。

4 结论

本实验通过研究VEGF在MDCK、Hela细胞裸鼠模型肿瘤中的分布情况，以及对肿瘤结构进行分析，发现裸鼠皮下注射部位形成的肿瘤呈现结节状，高成瘤MDCK细胞裸鼠模型的肿瘤组织中有淋巴滤泡样结构的肿瘤细胞灶形成，VEGF在肿瘤靠近皮肤侧的组织阳性表达显著，肿瘤边缘细胞次之，肿瘤中心位置的细胞阳性表达最弱。由此推测，高成瘤MDCK细胞与Hela细胞可能有相同的致瘤性，但两者成瘤机制可能不同。同时结合VEGF具有促进肿瘤细胞生成、侵袭、转移等生理学功能，说明该蛋白可能通过改变肿瘤微环境促进肿瘤血管生成，对肿瘤的形成具有一定促进作用，也为研究通过抑制肿瘤新血管的生成阻止肿瘤发生提供理论参考。