基于单抗的免疫分析方法及其在兽药残留检测中的应用

张小雨，李木子，秦立得，王晓茵，孙晓亮，曹旭敏，宋翠平，古少鹏，赵思俊

（1.山西农业大学，山西晋中 030801；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

食品安全问题一直以来备受关注，尤其是肉、蛋、奶中的兽药残留问题。造成动物源性食品中兽药残留超标的主要是抗生素、合成抗菌药以及激素类和镇静剂类药物。动物源性食品中的兽药残留不仅会对人类健康造成威胁，还会诱导药物产生耐药性，继而引发公共卫生问题，此外排入环境水体中的含有药物残留的动物粪便也会对生态环境安全造成影响[1-2]。因此，开展科学、有效的兽药残留检测是监督控制药物滥用的手段之一。免疫学技术基于抗原、抗体的特异性反应，具有灵敏度高、稳定性好、操作简单、快捷等优点，已被广泛应用于兽药残留检测[3]。使用免疫分析方法的关键是要获得高质量的特异性抗体，而单克隆抗体（简称单抗）是由单一B 细胞克隆产生的，仅针对某一特定抗原表位的抗体[4]，其理化性状高度均一，生物活性单一，还具有纯度高、制备成本低等特点，因此单抗技术的应用与发展，对免疫分析方法的普及起了巨大推动作用。为此，本文主要对单抗的制备及基于单抗的免疫分析方法在兽药残留检测领域的应用进行简要综述。

1 单抗制备

1.1 人工抗原制备

兽药的相对分子质量一般都小于1 000，通常被认为是小分子，只有反应原性，缺乏免疫原性，属于半抗原，因而常以牛血清白蛋白（BSA）[5]、卵清蛋白（OVA）[6]、血蓝蛋白（KLH）[7]等蛋白质作为载体，与其偶联构成完全抗原，以此作为免疫原免疫动物使其产生免疫反应。

1.1.1 完全抗原合成 人工抗原的制备主要取决于目标小分子的分子结构，尤其是其活性基团的组成和化学结构[5-6]。一般而言，若小分子包含一个活性基团，活性基团就可以直接与载体蛋白偶联成一个完全抗原。如果小分子不具有可与载体蛋白直接偶连的基团，则需要通过氧化、水解或还原等反应，获得活性基团后再与载体蛋白进行偶联[8]，而衍生物的产生使原有化学结构特征发生变化，进而会对免疫学特性造成一定影响，因此在化学改造过程中需引起注意。小分子的中间体也可用于合成含有代谢物或降解产物的半抗原。小分子与载体蛋白常见的偶联方法有碳二亚胺法[9]、戊二醛法[6]、重氮化法[10]、混合酸酐法[7]、活性酯法[5]、物理法[11]等。根据小分子半抗原的结构不同可选择不同的偶联方法：（1）通过碳二亚胺法、混合酸酐法和活性酯法，将小分子的羧基与载体蛋白的氨基进行偶联[12]，如雌二醇[5]、头孢噻呋钠[9]。（2）通过重氮法、戊二醛法，将其与载体蛋白偶联，如磺胺氯吡嗪钠[10]、克伦特罗[6]。（3）在不破坏小分子结构的情况下，利用离子之间的相互作用和疏水性，通过物理偶联方式与蛋白质结合形成完整抗原，如Liu等[13]制备的氨苄青霉素（AMP）人工抗原。为了突出小分子的结构特征位点，无论采用哪种偶联方法，小分子与蛋白质之间都有一定长度的连接臂。该结构的存在有利于产生针对目标小分子的抗体，且小分子与蛋白质的摩尔比通常为15:1～20:1[14]。

1.1.2 完全抗原纯化与鉴定 偶联反应产物中包含半抗原与蛋白的偶联物、未反应的半抗原、游离的蛋白质以及蛋白质自身聚合物，所以要对反应产物进行纯化，以获得纯度较高的人工抗原。常用的纯化方法有离心、透析和层析。除此之外，还要对人工合成的抗原进行鉴定，判定其结合情况。常用的抗原鉴定方法有动物免疫法[15]、电泳法[16]、光谱法[17]、质谱法[18]等。

1.2 单抗制备

用来制备单抗的动物主要有小鼠、大鼠和兔。动物种类的选择取决于所使用的骨髓瘤细胞类型。用于杂交瘤技术的小鼠骨髓瘤细胞系一般来源于BALB/c 小鼠，而大鼠骨髓瘤细胞系一般来源于LOU/c 大鼠，因此BALB/c 小鼠、LOU/c 大鼠是杂交瘤生产最常用的免疫动物。兔单抗是Katherine等[19]于1995 年首次在转基因兔中成功制得骨髓瘤样肿瘤后，又经Pytela 等[20]不断改进最终开始生产的。实验室常选择新西兰大白兔或日本单耳白家兔用于兔单抗制备。比起鼠单抗，兔单抗具有诸多优点：兔抗血清中的抗体亲合力通常较高，并且与鼠抗血清相比，还可识别更多的表位；兔单抗能识别许多不能引起小鼠明显免疫效果的抗原；此外，兔的脾脏更大，不仅可以将其用于更多的融合试验，还可大大提高高通量筛选融合细胞的可能性。

免疫方案应根据抗原性质不同而定，选择合适的免疫方案有利于提高细胞融合的成功率，并获得高质量抗体。免疫方案包括的因素有很多，如抗原性质、纯度、数量以及间隔时间、免疫途径、免疫次数、佐剂选择等。免疫间隔时间应当适宜，因为抗原刺激的时间间隔对再次引起的免疫应答水平起决定性作用。若间隔过短，则应答效果降低。这是因为初次应答产生的抗体水平依旧很高，可与再次刺激的抗原相结合，形成抗原-抗体复合物而被迅速清除[21]；免疫过于频繁，还可造成免疫原过量，使机体产生免疫耐受。若间隔太长，则应答效果也会降低。这是因为初次免疫后产生的抗体先呈对数增值，到达顶峰后就会激活机体的抑制作用，抗体增长速度开始下降，若此时对动物加强免疫则产生的抗体水平较低。常用的兽用免疫佐剂[22]包括油佐剂、蜂胶佐剂、脂质体佐剂、药物类佐剂、微生物成分及其产物佐剂、铝胶佐剂。常用的免疫途径包括皮下、肌内、静脉和腹腔注射等。综合考虑免疫操作方便程度与抗体效价等因素，实验室操作普遍采用皮下注射[23]。

应用杂交瘤技术制备目的小分子药物的单抗，通常选择6～8 周龄的BALB/c 小鼠，一般需要免疫4 次，免疫时通常加入弗式佐剂，免疫间隔时间一般为14 d 左右，每次免疫后7 d 检测效价，若第3次免疫后测定效价在1:10 000 以上则可以进行细胞融合。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用化学融合剂（聚乙二醇）[15]、物理方法（电刺激）[24]或者生物方法（仙台病毒）[25]促使这两种细胞融合，再用HAT 培养基进行选择性培养，得到融合的杂交瘤细胞，用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）筛选出能分泌目标抗体的阳性杂交瘤细胞并进行培养并克隆。采用紫外分光光度法[26]、SDS-PAGE 电泳法[18]（或结合薄层扫描分析[27]）、ELISA[28]和Western Blot[29]等方法测定纯化率、回收率以及免疫活性，以鉴定纯化抗体。

2 在兽药残留检测中的应用

ELISA与胶体金免疫层析法（gold immunochromatographic assay，GICA）是目前应用最广泛的基于单抗的兽药残留检测方法。目前，基于单抗制备的兽药残留ELISA 检测试剂盒、胶体金检测试纸条等被广泛使用，其准确度和精密度都符合国家要求；多数产品在研制的过程中不仅对其检测限、特异性进行了验证，同时选取一定的样品基质进行了检测，均取得较优的检测效果。但有一些检测方法或许是因为基质效应等问题，有一定的适用范围，不能用于所有的样品检测。

2.1 抗生素类

Burkin 等[30]用离子载体抗生素盐霉素（SAL）与BSA 的结合物作为免疫原免疫家兔，从而产生了能够紧密识别SAL（100%）及其结构类似物NAR（96.5%）的多克隆抗体，基于此建立了一种检测鸡肉、鸡蛋、牛奶中盐霉素的ELISA 方法。该方法对于SAL 及其甲基衍生物纳拉辛（NAR）的半数抑制浓度（IC50）分别为0.55 ng/mL 和0.57 ng/mL。值得注意的是此研究第一次报道了通过使用有机溶剂进行特殊的样品预处理，可使牛奶中的基质效应基本消除，平均回收率从32%提高到93%，并阐明该现象与牛奶中的Na+和K+有关。同时也对鸡肉与鸡蛋进行了预处理，发现一种简单的缓冲液提取法足以使鸡肉中的回收率高达87%～110%。对于鸡蛋，用乙腈（ACN）处理匀浆随后蒸发溶剂，可消除蛋液中的基质效应使回收率达67%～108%。

阿维菌素类药物（AVMs）是由链霉菌产生的一类新的大环内酯类抗寄生虫药物，包括阿维菌素（AVM）、伊维菌素（IVM）、依普利霉素（EPR）和埃玛菌素（EMA）等。Ni 等[31]选择AVM 的C4-OH 作为偶联位点与载体蛋白KLH 偶联制备免疫原，以突出显示属于免疫活性部分的AVM 的非糖部分，使AVM 的抗原决定簇远离C4-OH，并最大程度地突出AVMs 的共同结构。结果显示：制备的单抗具有广谱特异性，所建立的间接竞争ELISA（ic-ELISA）方法对猪肉、肝脏、肾脏、牛肉和牛奶样品中的AVMs 的交叉反应率分别为IVM（100%）、AVM（141.8%）、EPR（51.2%）和EMA（48.7%）。该方法对各种基质样品中AVMs 的检测限和定量限分别为0.5～5.4 μg/L和1.0～10.3 μg/L，方法回收率在78.1%～110.5%的范围内，变异系数低于14%。该方法制备的广谱特异性单抗及简单的样品制备方法，有利于实现AVMs 残留的高通量分析。

Guo 等[32]分别应用克林霉素（CLIN）、林可霉素（LIN）和吡利霉素（PIR）免疫小鼠，选出免疫效果最好的小鼠制备单抗并建立了GICA。该方法可在15 min 内用肉眼对试纸条结果进行半定量评估，磷酸盐缓冲液中的LOD 分别为CLIN（1 ng/mL）、LIN（10 ng/mL）和PIR（25 ng/mL），此外在牛奶、鸡蛋、牛肉和蜂蜜样品中的CLIN、LIN 和PIR 的检测限均可以满足检测要求。

2.2 化学合成抗菌药

王宇等[33]以氟甲喹（FLU）为原料建立了基于最佳异源包被（FLU-OVA）的ELISA。该方法的IC50为26.3 μg/L，检测限为4.0 μg/L，定量检测范围为8.0～114.0 μg/L（IC20—IC80），且与其他喹诺酮类药物及其结构类似物几乎没有交叉反应，特异性高。杨熠等[17]使用活性脂法，把恩诺沙星与载体蛋白OVA 进行偶联制备免疫原并制备了特异性的卵黄抗体，用ic-ELISA 确定包被原质量浓度为38 ng/mL，卵黄抗体的稀释倍数为1:64 000，方法的灵敏度（IC50）为18.207 ng/mL，LOD 为4.323 ng/mL，检测范围为7.350～45.102 ng/mL。与以往报道的方法相比，该方法较为灵敏，易操作，检测范围相对适宜。Lu 等[7]建立了可快速检测鲶鱼样品中硝基呋喃代谢物（AMOZ）的ic-ELISA与胶体金免疫层析试纸条，ic-ELISA 方法IC50为0.049 ng/mL，胶体金免疫层析试纸条的cut-off 为0.1 μg/kg，与之前的研究相比，具有较低的cut-off（0.1 μg/kg）和LOD（0.009 μg/kg）。免疫层析检测与ic-ELISA 检测的结果相关性较高，这一点已由LC-MS 确认。因此，该检测方法可作为检测AMOZ 的现场筛查工具，具有较高的灵敏度。

2.3 激素类和β-受体激动剂类药物

Wei 等[6]以戊二醛为交联剂，使其两个醛基分别结合微悬臂梁L-半胱氨酸的氨基与克伦特罗（CL）-OVA，一旦CL 抗体与CL-OVA 结合，微悬臂梁的表面应力就会发生变化从而发生偏转。微悬臂梁免疫传感器表面形成的免疫复合物越多，发生的偏转反应越大，因此微悬臂梁偏转反应程度与CL浓度呈正相关。研究还发现，该方法与沙丁胺醇、莱克多巴胺和多巴酚丁胺均无交叉反应。以猪肉为基质样本监测发现，该方法几乎不受基质干扰，检测限低至1.0×10-2μg/L，表明所制备的免疫传感器对检测CL 具有较高的灵敏度。

Wang 等[28]以制得的抗氢化可的松（HDS）单抗建立了可检测牛奶中HDS 的ic-ELISA 方法和免疫层析法。该方法的IC50为0.095 ng/mL，检测限为0.013 ng/mL，线性检测范围为0.026～0.356 ng/mL，与HDS 类似物的交叉反应性＜5%。研究开发的ic-ELISA 和条带分析法能够快速、灵敏地检测牛奶样本中的HDS 残留，其中免疫层析法在5～10 min 内即可产生结果。

Yang 等[15]以己烯雌酚（DES）偶联BSA 免疫小鼠制成高亲和力、特异性单抗，建立了可检测鱼肉及猪肉中DES 残留的ic-ELISA 方法。该方法灵敏度为0.49 μg/kg，检测限为0.075 μg/kg，比色谱、液相等仪器分析更具成本效益，所需时间更短，并且易于专业人员操作。因此，其有可能成为检测动物源性食品样品中DES 残留的快速筛查工具。

2.4 镇静剂类药物

Shan 等[34]以小分子药物氯硝西泮偶联BSA作为免疫原，免疫小鼠制得单抗，并以此建立了可同时检测猪样品（肌肉、肝脏和肾脏）中氯硝西泮、氟硝西泮、硝西泮、地西泮和奥沙西泮等5 种苯二氮卓类药物的间接ELISA 方法。该方法不仅广谱而且检测限低至0.2～1.5 ng/mL。Wang 等[35]利用制备的地西泮簇特异性单抗，建立了可同时检测7 种苯二氮卓类药物的ic-ELISA 方法，交叉反应率从高到低依次为去甲西泮（140%）、地西泮（100%）、硝西泮（49%）、替马西泮（32%）、奥沙西泮（17%）、艾司唑仑（7.5%）和阿普唑仑（2.4%）。该方法的IC50为8.9 ng/mL，且不需要复杂的样品制备和清洗，确保了更大的检测量，并满足了苯二氮卓残留分析的要求。孙文佳等[36]首次报道了基于氯丙嗪（CPZ）建立的间接竞争化学发光酶免疫检测方法。该方法的IC50为0.12 μg/L，检测限为0.02 μg/L，线性范围为0.02～24.78 μg/L，以猪肉为基质检测的回收率为87.4%～105.6%；与其他结构类似物没有明显交叉反应，具有较高的灵敏度和较好的稳定性。刘伟[37]等第一次制备了氯丙嗪（CP）的单抗，并建立了对应的ic-ELISA 法。该方法的IC50为0.73 ng/mL，明显优于之前文献报道的ELISA 法（IC50为20 ng/mL）。

3 展望

近年来小分子化合物检测方法的研究日趋多样化。在单抗科技蓬勃发展的同时，也促进了商品化免疫试剂盒的普及，以单抗为基础的食品检验系统将在国际市场中占有日益重要的地位。虽然ELISA 与GICA 被广泛使用，但这些方法在实际检测中有一定的局限性：高度特异性的单残留检验产品通常只能检出一种靶标化合物，而在实际工作中往往偏向于需要快速检出多种药物残留；基于GICA 的多残留检验产品也均限于单个检测线的多残留检验。因此，此类快速检验的产品往往无法精确界定、量化，且仅限于对几种药物的检测，仅适用于对样品的初筛。

很多学者认为ELISA法与GICA法简单、快速、灵敏且检测产品携带方便，是现场即时筛查的一种理想手段[38]。依前文所述，该方法虽然优点居多，但其实现快速、准确呈现结果需基于对样品进行一定的前处理，而最简单的前处理方法也需要对样品进行离心、稀释、过滤等操作，检测复杂样品时则前处理会更加复杂，因此其便捷仅仅建立在对药物的测定环节。ELISA 法与GICA 法在实际操作中较易出现假阳性，这也给实际操作带来了困扰。传统的具有一条检测线的胶体金免疫层析产品，只可以定性检测样品中的一种药物，或者对样品中的某种药物进行半定量。虽然可以通过在同一层析膜上组合多条单一颜色检测线来改善其检测范围和定量精度[39]，但由于检测线与样品垫距离的延长，不仅反应时间被延长，还存在更多无法预估的干扰[40]。

研究新型的免疫分析技术，可提高检验敏感度、稳定性、特异性、便捷性和检测通量。例如，通过研究纳米材料聚集实现免疫层析试纸条（ICTS）的信号放大。因为单个纳米材料发光强度是有限的，为了增强检测信号强度，研究者开始探索将纳米材料聚集在一起来实现信号增强的目的。Yao等[41]将纳米金材料分别标记抗体和抗抗体，使其在试纸条上形成纳米金-抗体-二抗-纳米金复合物进而实现了纳米金材料的聚集。该方法对17β-雌二醇的检测限为0.5 ng/mL，和传统方法相比，灵敏度提高了3 倍。Yin 等[42]通过纳米金材料的聚集实现了对食品样品（猪肉、虾和鸡蛋）中的呋喃唑酮代谢物检测，检测限低至0.6 ng/mL。

为进一步探索单抗在兽药残留检测中的应用，结合采用表面增强拉曼光谱（SERS）技术和金标检测试纸（LFA）实现超灵敏检测[43]，采用微流控免疫分析芯片技术联合ELISA 的原理实现高通量检测[44]等。诸多研究将为基于单抗的免疫分析方法在兽药残留检测中的应用提供新思路。