鲜积雪草化学成分的分离鉴定

黄颖雪 缪丽兰 田明明 吴继春

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

积雪草Centellaasiatica(L.)Urb.为伞形科积雪草属多年生匍匐草本植物，广泛分布于长江流域以南各地。积雪草用药历史悠久，始载于《神农本草经》，具有清热利湿、解毒消肿的功效，主要用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、石淋热淋、痈肿疮毒、跌扑损伤等病症[1-2]。同时，鲜积雪草还是一种使用广泛的鲜药，内服或外用治疗流行性腮腺炎、传染性肝炎、带状疱疹等[3]。目前，已从该植物中发现三萜及其苷类、多炔类、挥发油、黄酮类、生物碱等化学成分[4]。药理研究[5]表明，积雪草提取物具有抗肿瘤、抗纤维化、抗炎、抗阿尔兹海默症、改善学习记忆能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修复皮肤损伤等作用，积雪草苷被认为是发挥相关功效的主要活性成分。此外，积雪草总黄酮还具有促进组织愈合、止血、止痛等活性[6]。对鲜积雪草化学成分的研究未见报道。研究表明，鲜药与干药中的化合物种类和含量可能存在差异，药理作用也有区别[7]。据此，本实验对鲜积雪草全草95%乙醇提取物的化学成分进行分离鉴定，得到7个化合物，其中3个化合物为首次从积雪草中分离得到。报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker Avance Neo-400 MHz核磁共振波谱仪(TMS为内标，德国Bruker公司)；Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；WFH-308B型三色紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；数显热风枪(德力西电气)。

1.2 材料 柱层析硅胶(200～300目、300～400目，青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(美国GE公司)；GF254薄层硅胶板(青岛海洋化工有限公司)。其它试剂均为分析纯。实验药材于2019年11月采自贵州省贵阳市花溪大学城，由贵州中医药大学江洪副教授鉴定为伞形科植物积雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的新鲜全草。

2 提取与分离

鲜积雪草全草100 kg，洗净切碎，95%乙醇(200 L)浸泡提取4次，提取液减压浓缩得浸膏3.0 kg。总浸膏混悬于10 L水中，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。石油醚萃取部分(640 g)经硅胶柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯(100∶0→0∶100)梯度洗脱，得到5个流分Fr.A～Fr.E。Fr.B经硅胶柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脱，得到Fr.B-1～Fr.B-2两个流分。Fr.B-1经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脱)、Sephadex LH-20柱层析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脱)得到化合物1(150 mg)。Fr.C重结晶(乙酸乙酯)得化合物2(15 g)；母液经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脱)、Sephadex LH-20柱层析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脱)得到化合物3(20 mg)。乙酸乙酯萃取部分(100 g)通过硅胶柱层析，二氯甲烷∶甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.F～Fr.I。Fr.G采用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇=50∶1洗脱)、Sephadex LH-20柱层析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脱)，最后重结晶(甲醇)得到化合物4(15 mg)。Fr.H采用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脱)、Sephadex LH-20柱层析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脱)，得到化合物5(10 mg)。Fr.I采用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脱)分为Fr.I-1～Fr.I-3。Fr.I-1和Fr.I-3的沉淀分别用乙醇反复洗涤、离心得到化合物6(8.0 g)、7(10 g)。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色油状，易溶于石油醚、二氯甲烷，分子式为C17H22O3。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.95 (1H，dd，J=8.6，4.3 Hz，H-8)，5.70 (1H，m，H-2)，5.48 (1H，dq，J=15.6，7.5，5.3 Hz，H-10)，5.26 (1H ddd，J=22.3，13.3，5.6 Hz，H-9)，5.01 (1H dd，J=10.5，5.2 Hz，H-1)，4.72 (1H，t，J=5.0 Hz，H-3)，1.98 (2H，dd，J=10.0，4.8 Hz，H-11)，1.88 (3H，s，H-17)，1.21 (2H，t，J=7.1 Hz，H-12)，1.12 (4H，m，H-13，14)，0.72 (3H，dt，J=10.7，5.0 Hz，H-15)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：169.7 (C-16)，136.2 (C-10)，135.8 (C-2)，123.7 (C-9)，116.8 (C-1)，79.0 (C-4)，75.9 (C-7)，69.4 (C-5)，69.4 (C-6)，62.9 (C-3)，60.1 (C-8)，31.2 (C-13)，28.6 (C-12)，27.6 (C-11)，22.3 (C-14)，20.7 (C-17)，13.9 (C-15)。以上数据与文献[8]中的化合物8-acetoxyfalcarinol相似，但是对比1H NMR和13C NMR谱发现，化合物1比化合物8-acetoxyfalcarinol少了两个亚甲基。通过CAS SciFinder数据库检索发现，化合物1与文献[9]中的化合物Ⅲ数据一致，故鉴定化合物1为3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1，9)-diin-(4，6)。

化合物2：白色针状结晶，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶剂，分子式为C29H50O。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.30 (1H，m，H-6)，0.97 (3H，s，H-19)，0.88 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.81 (3H，m，H-27)，0.78 (3H，d，J=1.7 Hz，H-26)，0.75 (3H，d，J=6.9 Hz，H-29)，0.65 (3H，d，J=7.4 Hz，H-18)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：140.7 (C-5)，121.4 (C-6)，71.5 (C-3)，56.7 (C-14)，55.9 (C-17)，50.0 (C-9)，45.7 (C-24)，42.2 (C-4)，42.1 (C-13)，39.6 (C-12)，37.1 (C-1)，36.4 (C-10)，36.0 (C-20)，33.8 (C-22)，31.8 (C-8)，31.7 (C-2)，30.1 (C-7)，29.0 (C-25)，28.2 (C-16)，25.9 (C-23)，24.2 (C-15)，22.9 (C-28)，20.9 (C-11)，19.7 (C-26)，19.2 (C-19)，18.9 (C-27)，18.6 (C-21)，11.9 (C-29)，11.8 (C-18)。以上数据与文献[10]一致，故鉴定化合物2为β-谷甾醇。

化合物3：棕黄色油状，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶剂，分子式为C21H38O4。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.39 (4H，m，H-9，10，12，13)，4.14 (3H，pd，J=11.7，4.8 Hz，H-1′，2′，3′)，2.34 (2H，t，J=7.5 Hz，-CH2-COO)，0.88 (3H，t，J=4.1 Hz，H-18)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.8 (C-1)，130.1 (C-10)，129.9 (C-12)，128.0 (C-13)，127.8 (C-9)，68.3 (C-2′)，65.0 (C-1′，C-3′)，34.0 (C-2)，31.8 (C-6)，31.4 (C-16)，29.5 (C-7)，29.3 (C-15)，29.1 (C-4)，29.0 (C-5)，27.1 (C-8，C-14)，25.6 (C-11)，24.8 (C-3)，22.5 (C-17)，14.0 (C-18)。以上数据与文献[11]一致，故鉴定化合物3为1，3-dihydroxylpropyl-(9Z，12Z)-octadeca-9，12-dienate。

化合物4：乳白色颗粒，溶于甲醇；分子式为C10H10O4。1H NMR (400 MHz，MeOD)δ：7.58 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.16 (1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.05 (1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，6.80 (1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.30 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.87 (3H，s，-CH3)；13C NMR (100 MHz，MeOD)δ：170.9 (C-9)，150.4 (C-3)，149.3 (C-4)，146.9 (C-8)，127.7 (C-1)，123.9 (C-6)，116.4 (C-5)，115.8 (C-2)，111.6 (C-7)，56.4 (C-10)。以上数据与文献[12]一致，故鉴定化合物4为咖啡酸甲酯。

化合物5：黄色油状，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯，分子式为C15H20O2。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.92 (1H，ddd，J=17.0，10.1，5.4 Hz，H-2)，5.59 (1H，m，H-10)，5.51 (1H，dd，J=8.3，1.5 Hz，H-9)，5.47 (1H，d，J=1.4 Hz，H-1)，5.24 (1H，d，J=10.1 Hz，H-1)，5.19 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，4.93 (1H，d，J=5.2 Hz，H-3)，2.09 (2H，qd，J=7.3，1.4 Hz，H-11)，1.38 (2H，m，H-12)，1.27 (4H，m，H-13，14)，0.87 (3H，t，J=6.8 Hz，H-15)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：135.6 (C-2)，134.5 (C-10)，127.5 (C-9)，117.3 (C-1)，79.74 (C-7)，78.1 (C-4)，70.2 (C-5)，68.6 (C-6)，63.3 (C-3)，58.4 (C-8)，31.3 (C-14)，28.8 (C-12)，27.5 (C-11)，22.4 (C-13)，13.9 (C-15)。以上数据与文献[13]一致，故鉴定化合物5为araliadiol。

化合物6：黄色粉末，溶于甲醇；分子式为C15H10O6。1H NMR (400 MHz，MeOD)δ：8.07 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.89 (2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，6.37 (1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.16 (1H，d，J=2.1 Hz，H-6)；13C NMR (100 MHz，MeOD)δ：177.2 (C-1)，165.5 (C-7)，162.4 (C-5)，160.4 (C-4′)，158.1 (C-9)，147.9 (C-2)，137.0 (C-3)，130.6 (C-2′，C-6′)，123.6 (C-1′)，116.2 (C-3′，C-5′)，104.5 (C-10)，99.2 (C-6)，94.4 (C-8)。以上数据与文献[14]一致，故鉴定化合物6为山柰酚。

化合物7：黄色粉末，溶于甲醇；分子式为C15H10O7。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ：7.67 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.54 (1H，dd，J=8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.88 (d，J=8.5 Hz，H-5′)，6.40 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR (100 MHz，DMSO-d6)δ：175.3 (C-4)，163.4 (C-7)，160.2 (C-5)，155.6 (C-9)，147.1 (C-2)，146.2 (C-4′)，144.5 (C-3′)，135.2 (C-3)，121.4 (C-1′)，119.4 (C-6′)，115.1 (C-5′)，114.5 (C-2′)，102.5 (C-10)，97.6 (C-6)，92.8 (C-8)。以上数据与文献[15]一致，故鉴定化合物7为槲皮素。

4 讨论

新鲜积雪草总浸膏采用硅胶、Sephadex LH-20凝胶柱层析等方法进行分离纯化，通过核磁共振波谱数据鉴定结构，得到7个化合物，分别是3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1，9)-diin-(4，6)(1)、β-谷甾醇(2)、1，3-dihydroxylpropyl-(9Z，12Z)-octadeca-9，12-dienate (3)、咖啡酸甲酯(4)、araliadiol (5)、山柰酚(6)、槲皮素(7)。其中化合物1、5是聚炔类化合物。聚炔具有抗微生物、抗肿瘤、异株克生等活性[16]。化合物1的活性研究未见报道，化合物5具有抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)生长[13]和保护神经[17]等作用。虽然前人也从积雪草中得到多种聚炔成分，但是对这些成分的活性研究较少，有待深入。化合物6和7是黄酮类化合物，本实验发现这两个化合物在新鲜积雪草中含量较高。有文献[18]报道积雪草中的山奈酚含量较低，与本实验结果矛盾。化合物6具有抗肿瘤、治疗糖尿病和骨质疏松、保护损伤细胞等作用[19]，化合物7具有抗糖尿病、抗高血压、抗阿尔茨海默病、抗衰老及保护心血管等作用[20]。积雪草总黄酮在治疗慢性肛裂的过程中能够促进组织聚合、止血、减少疼痛[6]，今后可以针对积雪草中的黄酮单体化合物展开相关研究。化合物1、3、4为首次从积雪草中分离得到，同时化合物6的含量与前人报道矛盾，表明干鲜积雪草的化合物种类和含量可能均有差异。后续还需要系统分析产地、采收期、加工过程等因素对积雪草的化学成分和功效的影响，为合理开发利用这一药材提供依据。