过表达NFKBIZ对膀胱癌细胞周期及凋亡的影响

徐涛 陶佳意 刘辉勇 占志兵 李宋 王斌

膀胱癌是全球第九大最常见的癌症类型,每年约新增40万确诊病例[1]。全球癌症统计数据表明,膀胱癌每年造成约13万人死亡[2]。近年来,膀胱癌的诊断和治疗均取得了较大进展,但5年内复发率和转移风险仍较高,预后差。因此,膀胱癌发生、发展的分子学机制仍有待更深层次的探究,以期发现新的诊断和治疗方案。

NFKBIZ基因编码的IκBζ是新发现的IκB家族成员,可激活炎症因子NF-κB。NFKBIZ由Toll样受体12信号诱导,可以同时激活典型和非典型的NF-κB信号通路[3-5]。NFKBIZ是炎症、细胞增殖和存活的重要调节因子[6-8]。有研究表明,NFKBIZ在膀胱癌中低表达,上调NFKBIZ的表达可通过PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖[9]。为了更好地说明NFKBIZ在膀胱癌中发挥的重要作用,本研究使用慢病毒构建稳定转染膀胱癌细胞株,探究过表达NFKBIZ后对膀胱癌细胞周期及凋亡的影响。

材料与方法

一、材料

人膀胱癌细胞系(T24、5637细胞)购于美国典型培养物保藏中心。胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购于美国Gibco公司;β-actin、Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclinE1)和p27抗体、山羊抗兔抗体均购于美国Abcam公司;慢病毒表达载体购于上海和元生物技术有限公司(货号H14737);RPMI-1640培养液、双抗、Marker、SDS凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒均购于武汉谷歌生物有限公司;CCK-8试剂盒购于武汉塞维尔公司;Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购于杭州联科公司(货号70-AP105-100)。酶标仪购于美国Perkin Elemr公司;压力蒸气灭菌锅购于日本Sanyo公司;超净工作台购于苏净安泰公司;高温烤箱购于上海精宏公司;电子天平购于德国Sartorius公司;微量移液器购于Eppendorf公司;离心机购于德国Thermo公司;37 ℃恒温水浴箱购于天津泰斯特公司;超纯水仪购于美国Millipore公司;倒置显微镜和正置荧光显微镜购于日本Olympus公司。

二、细胞培养

T24在添加了10%胎牛血清和1%的青霉素-链霉素的F-12K培养液中培养,5637细胞在添加了10%胎牛血清和1%的青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中培养,将所有细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养孵育。

三、构建过表达NFKBIZ稳定转染细胞株

将T24和5637细胞各分为对照组和实验组,对照组转染慢病毒空载体NC,实验组转染慢病毒过表达NFKBIZ。后文使用NC组代表对照组,NFKBIZ组代表实验组。

四、细胞增殖实验

使用CCK-8法检测各组细胞活力。将各组细胞加入胰蛋白酶消化后离心重悬,细胞计数后,再加入到96孔板中,每孔加入100 μl细胞悬液(约10 000个细胞),再置入培养箱中培养1～4 d,将每孔中加入10 μl CCK-8试剂,孵育2 h后放置到酶标仪中测定每孔波长在450 nm处的吸光度(OD)值。

五、平板克隆实验探究过表达NFKBIZ后细胞增殖能力的变化

将各组细胞用胰蛋白酶消化后离心加培养液,制成细胞悬液。每孔2 ml培养液中加入1 000个细胞,摇晃6孔板使细胞均匀铺开,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养10～14 d,期间可根据情况换液。

当显微镜可观察到6孔板中出现肉眼可见的细胞团时,弃去培养液,用PBS缓冲液洗涤2次。再用甲醇固定30 min后,用PBS缓冲液洗涤2次,空气干燥3 min。最后使用0.1%结晶紫染色30 min,PBS缓冲液洗涤2次,空气干燥3 min。肉眼观察细胞克隆集落并计数。

六、Western blot检测各组细胞目的蛋白、凋亡相关蛋白及细胞周期相关蛋白的表达情况

待细胞长满培养皿,使用胰蛋白酶收集细胞,裂解后提取总蛋白,使用BCA法测定各组细胞,进行蛋白定量,使用SDS-PAGE凝胶电泳,用Odyssey红外荧光扫描系统检测条带,检测各上样孔的灰度值,灰度值即表达其蛋白的表达水平,并对结果进行分析。

七、流式细胞术检测细胞凋亡率

使用胰蛋白酶消化细胞后,将细胞置于离心机,1 200 r/min,离心5 min,除去上清。用1×Bingding Buffer将细胞重悬。再分别加入APC、7-AAD染色液,柔和混合,在正常温度下,避光孵育15 min后再加入1×Bingding Buffer,柔和吹匀。最后,使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

八、流式细胞术检测细胞周期

使用胰蛋白酶消化细胞后,加入预冷的80%乙醇在4 ℃固定4 h以上,离心后用预冷的PBS润洗2次,37 ℃孵育30 min后加入400 μl PI(50 μg/ml),4 ℃避光染色30 min,最后使用流式细胞仪检测细胞周期。

九、统计学方法

所有数据均使用SPSS 16.0统计学软件进行分析,数据用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、过表达NFKBIZ可抑制膀胱癌细胞的增殖能力

使用CCK-8法连续4天测定各组细胞的OD值,结果显示过表达NFKBIZ后,NFKBIZ组细胞活力明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

A:CCK-8法检测过表达NFKBIZ后T24细胞活力受到抑制(与NC组相比 *P<0.05);B:CCK-8法检测过表达NFKBIZ后5637细胞活力受到抑制(与NC组相比 *P<0.05)

平板克隆实验结果显示,过表达NFKBIZ后,膀胱癌细胞的增殖能力显著降低,见图2。

A、B:T24细胞过表达NFKBIZ后与NC组相比,细胞克隆数显著减少;C、D:5637细胞过表达NFKBIZ后与NC组相比,细胞克隆数显著减少

二、过表达NFKBIZ可促进细胞凋亡并抑制膀胱癌细胞的增殖

使用Western blot检测各组细胞中凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3和抗凋亡蛋白Bcl-2表达情况来验证过表达NFKBIZ对细胞凋亡的影响,进而解释其对膀胱癌细胞增殖的抑制作用。结果显示,过表达NFKBIZ后,Bax和cleaved-caspase3蛋白的表达显著升高,但是Bcl-2蛋白的表达显著降低,见图3。

A:过表达NFKBIZ后,Bax和cleaved-caspase3的表达随之升高,Bcl-2的表达水平显著下降;B:NFKBIZ组较NC组,Bax表达显著升高(**P<0.01);C:NFKBIZ组较NC组,cleaved-caspase3表达显著升高(**P<0.01);D:NFKBIZ组较NC组,Bcl-2表达显著降低(**P<0.01)

三、过表达NFKBIZ可促进细胞凋亡

使用流式细胞术检测细胞凋亡率后发现,正常组T24细胞的凋亡率为正常水平,而NC组的细胞凋亡率有所增高,NFKBIZ组较NC组的凋亡率进一步增高,见图4A、B。同样,正常组5637细胞凋亡率处于正常水平,而NC组的细胞凋亡率有所增高,NFKBIZ组较NC组的细胞凋亡率进一步明显增高,见图4C、D。

四、过表达NFKBIZ可使膀胱癌细胞周期阻滞

我们通过流式细胞术检测细胞周期变化后发现,和NC组相比,NFKBIZ组G1/S期的细胞周期受到阻滞,见图5。

A、B:过表达NFKBIZ后,T24细胞周期分布情况;C、D:过表达NFKBIZ后,5637细胞周期分布情况

五、过表达NFKBIZ可阻滞细胞周期并抑制膀胱癌细胞的增殖

我们通过Western blot检测CDK2、cyclinE1及p27蛋白的表达来验证过表达NFKBIZ对细胞周期的影响。结果显示,过表达NFKBIZ后,CDK2和cyclinE1蛋白的表达明显降低,但是p27蛋白的表达显著升高,见图6。

A:过表达NFKBIZ后,CDK2和cyclinE1的表达随之下降,p27的表达水平显著升高(**P<0.01);B:NFKBIZ组较NC组,CDK2表达显著减少(**P<0.01);C:NFKBIZ组较NC组,cyclinE1表达显著减少(**P<0.01);D:NFKBIZ组较NC组,p27表达显著升高(**P<0.01)

以上实验结果均表明,过表达NFKBIZ可诱导细胞凋亡并使细胞周期阻滞,进而抑制膀胱癌细胞增殖。

讨 论

膀胱癌是泌尿系统主要肿瘤之一,其发病率和死亡率均较高,具有高转移率及复发率[10-12]。将2020年对185个国家的统计数据与2018年相比,膀胱癌的年发病人数增加了3万,年死亡人数则增加了近2万,同往年的数据一样,膀胱癌的发病率及死亡率持续增加,根据模型预测,到2040年,膀胱癌发病人数可能会翻一番[13]。因此,深入研究膀胱癌发生、发展中的分子机制,对膀胱癌的临床诊治具有重大意义。

NFKBIZ是一种抑癌基因,其多态性和突变已被证实与多种疾病有关,包括银屑病[14]、自发性皮肤炎症[15]、侵袭性肺炎球菌病[16]和克罗恩病[17],这些疾病大多数与炎症有关。此外,NFKBIZ也被报道与癌症有关。比如,NFKBIZ在神经胶质瘤中表达上调,并与不良预后相关[18]。在最常见的原发性皮肤T细胞淋巴瘤类型-蕈样肉芽肿中发现NFKBIZ表达水平下调[19]。有研究发现,NFKBIZ基因突变小鼠的肿瘤增殖能力显著降低,人类结直肠癌细胞中NFKBIZ基因可影响细胞增殖[20]。

细胞凋亡是细胞降解的过程,细胞凋亡作为调控细胞死亡的主要机制,对正常细胞的存活、免疫系统、胚胎发育和化学性诱导的细胞死亡都是不可或缺的。有研究表明,无论是抑制细胞自噬或激活细胞凋亡,均可在抑制膀胱癌的发展中起到重要作用[21-22]。

CDK2和cyclinE1在G1期诱导DNA合成增加,而p27作为细胞周期负性调控因子,通过抑制CDK而阻滞细胞周期变化,进而抑制肿瘤的形成[23]。

本研究中,在膀胱癌T24及5637细胞建立NFKBIZ过表达稳定转染细胞株后,CCK-8实验结果与平板克隆实验结果均显示,过表达NFKBIZ使细胞增殖能力降低。Western blot结果显示,Bax和cleaved-caspase3蛋白的表达明显升高,但Bcl-2蛋白的表达明显减少,表明过表达NFKBIZ后,细胞凋亡被激活;CDK2和cyclinE1表达明显降低,但p27表达明显升高,表明过表达NFKBIZ后,G1/S期的细胞周期受到阻滞。使用流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期,结果显示过表达NFKBIZ后,细胞凋亡率明显提高,且细胞周期受到阻滞。以上结果均表明,过表达NFKBIZ可促进细胞凋亡、阻滞细胞周期变化,进而抑制膀胱癌细胞的增殖。但本研究仅通过慢病毒上调NFKBIZ的表达,未进行敲低实验来反复验证。此外,我们拟通过敲低和过表达NFKBIZ探索其对细胞自噬的影响、能否激活自噬性铁死亡以及探讨NFKBIZ与化疗敏感性的关系,这也将在今后的工作中进一步完善。

综上所述,通过慢病毒构建NFKBIZ过表达膀胱癌细胞T24及5637稳定转染细胞株,能使膀胱癌细胞的细胞周期受到阻滞,并诱导细胞凋亡。这表明,NFKBIZ作为抑癌基因,与膀胱癌的发生、发展密切相关,上调其表达能抑制膀胱癌的发生、发展,是潜在的诊断及治疗靶点,值得进一步研究。